原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用

组的屏障，首先必须使亲株原生质体化，以便很好地制 亚门是以脱乙酰几丁质为主要成分；子囊菌亚门（半子
备原生质体，这是提高原生质体的再生率与融合率的 囊菌除外） 和担子菌亚门则以几丁质、β－葡聚糖为
基础。因此，原生质体化是原生质体融合的第一个关键 主。同一种真菌的不同发育时期或不同菌态的细胞壁
步骤，同时，它也是保证实现各类原生质体技术的第一 成分不同，例如鲁氏毛霉的菌丝细胞壁含有岩藻糖和
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食品研究与开发
综述
方面的影响。有人认为对数早期和中期的菌丝体是成 胞核，通过蔗糖密度梯度离心，收集细胞核。将细胞核
败的关键。
与受体菌原生质体混合，在 ＰＥ Ｇ 和 Ｃ ａ２＋ 存在下进行融
菌丝体的菌龄对原生质体释放的影响主要由于壁 合，分离到基本培养基上选择融合子。这一转移机制
的成分和结构的变化引起。菌龄短的菌丝体的壁成分 为：在 ＰＥ Ｇ 和 Ｃ ａ２＋ 存在条件下，受体菌原生质体在融
相对简单，壁也相对薄些；随着菌龄增加，壁上沉积色 合过程中，随着细胞膜的融合，捕获了供体菌的细胞核
素等次生物质，酶的作用相对困难些，壁难以被溶解。 并将其摄入原生质体中。应用这一技术可研究核与核，
其本身的遗传特性决定，一般凝集性较好的酿酒酵母 ３ 结论
往往发酵度偏低。如果应用原生质体融合技术就能选
原生质体融合技术作为遗传育种的一个有效手
育出具有较高的发酵度又具有较强的凝集性的融合重 段，已广泛应用于微生物育种工作的各个方面。但是还
组菌株。
都只局限于两个菌之间的融合，没有扩展到 ３ 个以上
２．２ 优化菌种发酵特性［９］
在 １８５９ 年 Ｂａｒｙ 研究某些粘菌（Ｍｙｘｏｍｙｃｅｔｅｓ）的生 活史时，发现的这些菌有从单核细胞融合产生多核合 胞体（Ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｐｌａｓｍｏｄｉａ）的情况。这是世界上首 次发现的微生物细胞自发融合现象。原生质体融合 （Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ）技术起源于 ２０ 世纪 ６０ 年代。１９６０ 年
作者简介：王鑫（１９８３－），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术。 ＊ 通讯作者
法国的 Ｂａｒｓｋｉ［１］研究小组在两种不同类型的动物细胞 混合培养中发现了自发融合现象。同时，日本的 Ｏｋａｄａ［２］ 发现并证明了仙台病毒可诱发内艾氏腹水癌细胞彼此 融合，从而开始了细胞融合的探索。１９７４ 年 Ｆｅｒｅｎｃｙ［３］ 及其同事们率先人工诱导白地霉 （Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎ－ ｄｉｄｕｍ） 营养缺陷型突变株的原生质体融合获得成功。 从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技 术。１９７９ 年匈牙利的 Ｐｅｓｔｉ［４］首先提出了融合育种提高
外，原生质体融合的聚合剂种类、剂量、型号以及融合 质体数量的重要因素。它使菌丝细胞内外压力一致，使
处理的条件（如渗透压、离子种类浓度、ｐＨ 值、温度、时 菌丝细胞保持生理状况的稳定，原生质体完整地释放
间）等，也都会直接影响到原生质体的融合率。
出来，且保持原生质体不破裂也不收缩。其次，渗透压
１．３ 影响原生质体分离的因素
原生质体融合与融合子形成、原生质体或融合子再生、 １．３．２ 溶壁酶
正变融合子的筛选与保藏。
用酶法破壁制备原生质体，酶的作用无疑是关键
１．１ 原生质体融合的关键步骤［５］
的。不同种类真菌的细胞壁成分和结构是不同的，鞭毛
为了实现原生质体的融合，除去遗传物质交换重 菌亚门是以纤维素和 β－葡聚糖为主要成分；接合菌
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食品安全方面的需要。为了有效配合本市食品安全工 作，普及食品安全、饮食健康知识，于 ２００６ 年将 ２００３ 年创刊的《食品生产力》内部刊物进行全新改版，改版 后其内容更加突出食品安全，年发行量由 １ ２００ 本扩 大到 ３ ０００ 本，深受食品企业和消费者青睐。开展技术 咨询服务是“中心”为食品企业服务的又一特点，除网 站服务外，几年来他们通过具备 ＱＳ 认证资质的 ４ 名 高级工程师，先后为千余家企业提供了认证咨询，不但 使这些企业取得了认证资格，而且全面提升了企业的 产品质量和管理水平。为了提高食品企业从业人员专 业技能和综合素质，于 ２００４ 年注册了“天津市新科职 业培训学校”，具备了食品检验工、冷食操作工、熟肉制 品操作工、营养配餐员共 ４ 项劳动部门的发证资质，同
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青霉素产量的报告，开创了原生质体融合技术在实际 ０．０５ ％、磷酸二氢钾 ０．０４ ％、磷酸氢二钾 ０．１ ％、琼脂
工作中的应用，使原生质体融合技术成为工业菌株改 ２ ％）。ＰＤ Ａ ＋１０ ％稻草浸煮液培养基适合草菇分离原
良的重要手段之一。
生质体。研究发现 Ｃ Ｙ Ｍ 培养基适合银丝草菇分离原生
的菌之间的融合，如果我们能够开展多个菌之间的融
许多微生物能在较高的温度下生存，有的能在 合，则有可能获得同时具多个优良性状的菌株，进一
４５ ℃～６５ ℃甚至更高温度下生长。有的耐热菌可在 步扩宽这一技术的应用。并且原生质体融合技术运用
９８ ℃的温泉中生长繁殖。这种耐热特性在工业上具有 是否能成功仍受到客观因素的影响，这些都有待于我
时成立了下岗职工培训基地。几年来，针对社会的需 求，先后举办了食品安全、食品科技、标准化、制造业信 息化及下岗人员技能等免费培训班，５ ０００ 多人接受了 培训，８００ 多家企业从中受益。还先后举办了检化验员 培训班 ８ 期，营养配餐员培训班 ５ 期。
“中心”两刊、一站、一校的建立和发展壮大，已成 为连接政府、食品企业、科研院所以及消费者食品安全 的信息桥梁。
参考文献：
［１］ 中国天津食品网．“中国天津食品网”介绍 ［ＥＢ／ＯＬ］．（ ２００６－ ８－ ４） ［２００８ － ８ － ２５］． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｊｆｏｏｄ．ｃｏｍ．ｃｎ／ｎｅｗｓ／ｎｅｗｓ＿ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？ｉｄ ＝ １２１２１ 收稿日期：２００８－ ０８－ １４
综述
食品研究与开发
稳定剂的性质影响着裂解酶的反应活性。不同的裂解
１．３．１ 培养基成分
酶需要不同性质的渗透压稳定剂才能得到最佳的效
培养基成分的改变，直接或间接地影响着细胞壁 果。方芳等在分离台湾根霉原生质体时以糖醇为渗透
的状况，对原生质体的释放量也有显著影响。李东屏等 压稳定剂，酶解初期有原生质体释放，而 ３ ｈ～４ ｈ 后菌
质体。用 Ｃ Ｙ Ｍ 、ＰＤ Ａ 、ＰＭ Ａ 及 ＰＱ Ａ ４ 种培养基培养糙皮
１ 原生质体融合技术
侧耳（Ｐｌｅｕｒｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）的次生菌丝体，分离原生质体
各类不同的微生物，显然它们的形态，结构不同、 时，原生质体数有明显差别。用平菇子实体浸出液所配
遗传特性各异，生理代谢类型差异也很大，但对它们制 的 ＰＱ Ａ 培养基对糙皮侧耳原生质体释放的效果最佳。
②ＰＤ Ａ ＋１０ ％稻草浸煮液；③ＰＭ Ａ 培养基（马铃薯 反应起促进作用。
２０ ％、麦芽糖 ２ ％、琼脂 ２ ％）；④ＰＱ Ａ 培养基（马铃 １．３．４ 菌龄［７］
薯 ２０ ％、可溶性淀粉 ２ ％、琼脂 ２ ％）；⑤Ｃ Ｙ Ｍ 培养
菌丝体生理状况是决定原生质体产量的主要因
基（蛋白胰 ０．２ ％，葡萄糖 ２ ％，酵母汁 ０．２ ％、硫酸镁 素，而菌丝体的生理状况又受菌龄和培养基成分这两
ＴＨＥ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＯＰＬＡＳＴ ＦＵＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮ ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ ＢＲＥＥＤＩＮＧ ＷＡＮＧ Ｘｉｎ， ＣＨＥ Ｚｈｅｎ－ ｍｉｎｇ＊， ＨＵＡＮＧ Ｔａｏ－ ｒｕｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００３９，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｔｏ ｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａ－ ｔｉｏｎ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ａｓ ｗｅｌｌ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｍｉｃｒｏｂｅ； ｂｒｅｅｄｉｎｇ
个关键步骤。
半乳糖，而孢子壁内不含有这两种成分；孢子壁内含有
其次，融合后的原生质体必须顺利地再生出细胞 ４２．６ ％的葡萄糖，菌丝和念珠状细胞的壁内则不含有此
壁，进而形成完整的营养体细胞，才可能顺利地筛选出 成分；几丁质在所有菌态时期的细胞壁内部含有，但量
ห้องสมุดไป่ตู้
稳定的高产重组子。而且再生率愈高则筛选出正变菌 的多少则差别很大，其占细胞壁的干重，念珠状细胞为
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食品研究与开发
综述
原生质体融合技术 在微生物菌种选育中的应用
王鑫，车振明 ＊，黄韬睿 （西华大学 生物工程学院，四川 成都 ６１００３９）
摘 要：对原生质体融合技术的关键步骤、影响原生质体融合和分离的因素进行了综述。就原生质体融合技术在微 生物育种技术上的应用前景进行了分析。 关键词：原生质体融合；微生物；菌种选育
分别曾用 ５ 种培养基培养草菇和银丝草菇（Ｖ ．ｂｏｍ － 丝在酶液中生长起来，可见糖醇大大降低或是抑制了
ｂｙｃｉｎａ）的菌丝，制备原生质体。这 ５ 种培养基为：① 酶的反应活性，促使菌丝得以生长。而以 Ｋ Ｃ ｌ或 Ｎ ａＣ ｌ
ＰＤ Ａ 培养基（葡萄糖 ２ ％、琼脂 １．５ ％、马铃薯 ２０ ％）； 为渗透压稳定剂，则可能有助于酶与底物的结合，对酶
株的机率和可能性也愈大。因此，提高再生率则是原生 ８．４ ％，菌丝为 ９．４ ％，孢囊梗为 １８．０ ％，孢子为 ２．１ ％。
质体融合的另一关键步骤。
因此分离原生质体时，不同的真菌、同一种真菌的不同
融合条件也是不可忽视的，因为只有通过这一环 发育时期、不同培养方式，对溶壁酶的种类和浓度要求
节才能实现遗传物质的交换与重组，形成融合子与稳定 有所不同。
备原生质体，并对其进行融合的程序有类似之处，原生 草菇和银丝草菇都属于小包脚菇属 （Ｖ ｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）的真
质体融合的关键步骤也是基本一致的。微生物原生质 茵，对培养基的要求则有所不同，ＰＤ Ａ ＋１０ ％稻草浸煮
体融合技术的基本程序包括：原生质体的制备与形成、 液培养草菇较好，Ｃ Ｙ Ｍ 培养基培养银丝草菇效果较好。
但菌龄过短，又会造成菌丝量不足，或影响原生质体的 以及核与胞质之间的相互关系，并为育种工作提供了
再生。不同种类的真菌对酶解时最佳菌龄是不同的。 新的模式。
２．５ 原生质体融合技术在其它微生物育种方面的应用
２ 应用
裘娟萍等以原生质体融合技术构建广谱抗噬菌体
原生质体融合技术在微生物育种中的应用已经相 菌株。肖在勤等将热灭活的凤尾菇原生质体与金针菇原
当广泛，应用范围主要包括以下几方面。
生质体融合，选出双亲细胞质和细胞核都融合的无锁状
２．１ 改良菌种遗传特性［８］
联合菌株，经融合核分裂技术处理后，融合核分裂成为
酿酒酵母是酿酒生产的菌种，在发酵后期，那些能 具有锁状联合的双核菌株。通过原生质体融合技术还可
凝集并形成絮状的酵母称凝集性酵母，而那些沉淀性 对耐热机理进行研究。如有一株耐高温酵母一旦经 Ｅ Ｂ
不好的酵母称为粉状酵母。具有良好凝集性的酵母可 诱变失去线粒体变为小菌落后，即失去耐高温特性。说
使酿酒发酵液澄清速度加快，降低酵母分离时的能量 明耐热性与线粒体有关系。因而应用原生质体技术对耐
消耗，并且还可防止酵母在发酵液中长时间悬浮，导致 热性的转移和对耐热机理进行研究将是一条途径。
细胞自溶而影响啤酒的风味。酿酒酵母的凝集特性由
重组子。只不过相对来说，前两个环节更为关键而已。 １．３．３ 渗透压稳定剂
１．２ 影响原生质体融合的因素［６］
渗透压稳定剂对原生质体的形成之所以重要，在
影响原生质体融合率的因素有很多，除了影响原 于其在菌丝与酶这样一个反应系统中起着一种媒介物
生质体制备与原生质体再生的因素均与融合率有关以 的作用。首先，渗透压稳定剂的浓度是维持和控制原生