生物芯片原理 PPT课件
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hybridization Hybridized probes(DNA molecules)are
fluorescently labeled
Comparison of DNA Chip Technologies
Oligo-Chip
8 n or 20 n
cDNA-Chip
< 2,000 n
Genomic Chip
基因芯片检测原理
荧光扫描成像用激光激发芯片上的样品发射 荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性 较高，荧光强；而不完全杂交的分子热力学稳 定性低，荧光信号弱；不杂交的无荧光。不同 位点的信号被扫描后由计算机软件处理，并对 每个点的荧光强度数字化后进行分析。
基因芯片数据分析
图像分析，Ratio值分析，基因聚类分析
基因芯片的原理
依据双螺旋原理，核酸分子杂交 技术，在靶标样品与探针之间进行选 择性反应，将反应一方，探针固定在 芯片上，另一方，荧光标记制备好的 cDNA，分别标记绿色的Cy3和红色的 Cy5通过流路或加至芯片上。
基因芯片流程
样品制备
杂交
芯片制备
杂交信号检测
数据分析
Biochip Based on Hybridization
Preparation of Traditional Nucleic Acid Probe
Amino acid sequence
GLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-----
GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC---
Nucleic acid sequence
The nucleic acid sequence is Deduced from amino acid sequence
Complementary DNA hybridize
Each spot contains known DNA Signal appears
实验流程
影响杂交反应的因素
1 探针浓度 其浓度差异对信号有影响，浓度高信 号强。 2 阳离子 阳离子存在可提高异源杂交双链的生成 速度。 3 温度 ONA25~42C，cDNA 55~70 C 4 序列组成 芯片上一次产生上万个异源杂交反应， 应选择最协调条件。 5 高灵敏度监测系统，阅读仪。
基因芯片发展历史
Southern and Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Macroarray
Hybridization of Nucleic Acids
DNA1
DNA2
RNA
Probe
Northern
Southern
hybridization hybridization
1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界 上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯 片，并制作出相应的芯片系统。此外，美国的 Hyseq公司、Aurora公司、Nanogen公司、 Incyte公司等也在积极开展DNA芯片研究工作。 近二年，摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也 相继投以巨资加入生物芯片的研究开发。
图像分析 激光扫描仪得到的扫描图像文件通过划 格，确定杂交斑点的位置，然后经过过滤背景噪音， 提取得到荧光信号强度值，最后以数据列表的形式 输出。这一系列的工作都是依靠软件来完成，如 Biodiscovery， Imagene 7.0分析软件。
Ratio值分析 在常用的双色荧光芯片系统下，各杂交斑点的
我国是从一九九七年开始对生物芯片研究。
中国医药生物技术协会生物芯片分会2006年 在北京成立。
中国在北京、上海、陕西、天津、南京建立 了五大生物芯片研发和产业化基地 。
我国生物芯片产业尚未形成统一的技术标准， 不规范。在产品认证认可方面也存在与国际 惯例不接轨的情况。
生物芯片技术是20世纪90年代以来，影响 最为深远的重大科技进展。它是继大规模 集成电路之后的又一次具有深远意义的科 学技术革命。
Types of DNA Chips
DNA Chips ExpressionChips GenomicChips SequencingChips
生物芯片的原理
生物芯片利用空间位置固定事先已知的核酸、 蛋白质、脂质和碳水化合物分子
芯片技术对固定相分子的要求较高，要求生物 分子固定在芯片基质上之后仍要保持生物活性 的稳定。
c. 环氧已基片 表面的环氧已基直接与生物分子的 氨基共价结合；
d. N-羟基琥珀酰亚胺酯片 表面的N-羟基琥珀酰亚 胺酯基直接与生物分子的氨基共价结合。
DNA Chip Technology
Solid support. glass, plastic, metal, silicon. Miniaturized array of DNA (genetic material) Work on the biochemical principle of DNA/DNA
两色荧光cy3／cy5的比值又称R/G值。一般认为R ／G值在0.5～2.0范围内的基因不存在显著表达差 异，该范围之外则认为基因的表达出现显著改变。
由于实验条件的不同，该域值范围会根据置信区 间进行调整。处理后得到的信息可以根据需要以各 种形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始匡像 拼图等。将每个信号斑点的所有相关信息如位标、 基因名称、克隆号、PCR结果、信号强度、Ratio 值等自动关联并根据需要筛选数据。
点样的方式分接触式点样与非接触式点
样两种。接触式点样是点样针直接与固相支 持物表面接触，将生物分子样品留在固相支 持物上。非接触式点样以压电原理将样品通 过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法 的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打 印2 500个探针；缺点是定量准确性及重现 性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。
原位合成法
原位合成法 该方法技术比较复杂，除了 Affymetrix 等少数实力雄厚的生物芯片公司 可以用该技术外，其他的公司和实验室都是 采用点样法制作芯片。 原位合成方法有两种途径，一种是原位光刻 合成，该技术是由Affymerix公司的Fodor实 验室开发。该方法的主要优点是可以用很少 的步骤合成极其大量的多肽或寡聚核苷酸阵 列。
在分子杂交反应和洗片等处理过程中能稳定结 合所亲和的分子，防止其在杂交洗涤过程中被 冲洗掉，保证检测信息的准确可靠。
芯片片基
制作芯片片基的材料首先必须有很好的光学性质，能 利用光进行透射和反射的检测
芯片表面具有可以进行化学反应的活性基团，方便生 物分子的偶联而固定
芯片表面的活性化学基团有足够的吸附能力，要能结 合最佳容量的生物分子
Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.)
Hybridization efficiency (lots of factors)
Detection technology (signal type, efficiency, noise)
> 50,000 n
sequencing expression
expressio n
genomic analysis
Sensitivity of DNA chip assays
Probe and target DNA/RNA Complexity
Chip surface (autofluorescence and non-spec. bkg)
聚类分析 clustering analysis
从生物芯片的图像分析中可得到大量的数据， 要从中提取所需要的信息就必须对这些数据的统计 分析。通过建立各种数学模型，分析芯片图像数据 的生物学意义。
聚类分析是利用大量相关数据对事物进行分类 处理，其方法为直接比较样本中各种特征数据，将 特征相近的归为一类，差别较大的归为不同的类。
Chemical synthesis
Synthesizing oligonucleotide
PROBE GGGGACGAGTCCTCCGTTCT
基因芯片分类
按芯片制备方法分类 原位合成芯片（synthetic genechip） DNA微阵列芯片（DNA microaLeabharlann Baiduray）
按探针分类 寡核苷酸阵列 DNA阵列 基因芯片 cDNA芯片 RNA芯片
一个实例
基因芯片筛选宫颈癌相关基因的研究
摘要 本研究中采用细胞原癌、抑癌基因分类芯片
对原发性宫颈癌标本进行分析，以期探讨宫颈癌 基因组中存在的癌基因表达的变异，确定与宫颈 癌相关的候选原癌或抑癌基因，为宫颈癌的诊断 和治疗提供新的线索和依据。
实验结果
1 组织总RNA制备
本实验中共收集到宫颈癌组织0.96g，正常对照宫 颈组织0.56g，分别提取总RNA。两种宫颈组织的 总RNA提取的质量见表1
芯片要有很好的稳定性，具有一定的抗压能力，并且 在生物分子杂交反应过程中要处于惰性状态，不会发 生其他化学反应或其他物质吸附
生物芯片要有很好的兼容性，可以广泛应用于生物学 检测和研究
生物分子与芯片的结合
生物芯片表面的活性基团形成特异亲和生物 分子的位点，用来吸附和固定生物活性分子， 例如多肽、核酸、酶、抗体或抗原等
芯片上每平方厘米可密集排列成千上万 个生物分子，能快速准确地检测细胞、 蛋白质、DNA及其他生物组分，并获取 样品中的有关信息，其效率是传统检测 方法的成百上千倍。
生物芯片分析过程
点阵固定 光刻合成 微量点样 喷墨
光化学检测 电化学检测
洗涤 检测扫描
试样处理 纯化、标记
基因芯片的最大优点在于其高通量。传统方 法检测众多基因要经历多次实验而且自动 化程度低，因而每次实验之间是存在系统 误差的。基因芯片可以克服这个缺点，众 多基因的探针的标记、杂交等过程是在一 次实验过程中完成的，而且自动化程度高， 数据客观可靠
生物芯片原理
principle of biochip
医学院病毒所
本章提纲
生物芯片简介 生物芯片的分类 基因芯片基本原理、流程与应用 蛋白质芯片及应用
第一节 生物芯片简介
一、 什么是生物芯片 生物芯片主要指通过平面微细加工技
术，在固体芯片等载体上的微型生物化 学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、 核酸以及其他生物组分的准确、快速、 大信息量的检测
该技术被评为1998年度世界十大科技进展 之一。
发展趋势
缩微芯片实验室 生物芯片研究领域的 一个热点，它是将传统的生物化学样品 制备、生化反应、检测三个步骤集于一 体，缩小构成芯片上的实验室系统
第二节 生物芯片的分类
一般分类
信息生物芯片和功能生物芯片
第三节基因芯片的基本原理与流程
基因芯片技术是指通过微阵列(Microarray)技术 将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合 成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻 璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助 碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及检测 等研究的技术。
四 生物芯片的制作
基本方法 点样法和原位合成法 原位合成法 原位光刻合成
压电打印法
点样法 这一方法相对技术要求不高，是最
常用的方法。点样法是将预先合成好的探 针、PCR产物、蛋白或多肽、抗原或抗体 等经纯化、定量分析后，通过由阵列复制 器或阵列点样机准确、快速地将不同探针 样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或玻片 等相应位置上，再进行固定处理，如紫外 线交联固定。
另一种原位合成是压电打印法，主要用于合成 寡聚核苷酸探针，其原理与普通的彩色喷墨打印 机相似，所用技术为常规的固相合成方法。根据 芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷 印在芯片上特定位置，冲洗、去保护、偶联等与 一般的固相合成技术相同。
该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成 一致，不需要特殊制备的化学试剂，可以合成出 长度为40～50个碱基的探针。
根据芯片基片表面的活性基团的类型，芯片 可以分为氨基片、醛基片、环氧乙基片和N 一羟基琥珀酰亚胺酯片
根据不同的需要来选用芯片，如对大分子 DNA的吸附要用氨基片，对寡聚核苷梭或 小片段DNA要用醛基片
a. 氨基片 表面为氨基，直接与核酸分子的磷酸基团靠 电荷作用相结合
b. 醛基片 表面的醛基直接与生物分子的氨基共价结合
表1 总RNA提取结果
样品类型 标记
编号 总RNA量 OD260 OD280 OD260/OD280 荧光
fluorescently labeled
Comparison of DNA Chip Technologies
Oligo-Chip
8 n or 20 n
cDNA-Chip
< 2,000 n
Genomic Chip
基因芯片检测原理
荧光扫描成像用激光激发芯片上的样品发射 荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性 较高，荧光强；而不完全杂交的分子热力学稳 定性低，荧光信号弱；不杂交的无荧光。不同 位点的信号被扫描后由计算机软件处理，并对 每个点的荧光强度数字化后进行分析。
基因芯片数据分析
图像分析，Ratio值分析，基因聚类分析
基因芯片的原理
依据双螺旋原理，核酸分子杂交 技术，在靶标样品与探针之间进行选 择性反应，将反应一方，探针固定在 芯片上，另一方，荧光标记制备好的 cDNA，分别标记绿色的Cy3和红色的 Cy5通过流路或加至芯片上。
基因芯片流程
样品制备
杂交
芯片制备
杂交信号检测
数据分析
Biochip Based on Hybridization
Preparation of Traditional Nucleic Acid Probe
Amino acid sequence
GLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-----
GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC---
Nucleic acid sequence
The nucleic acid sequence is Deduced from amino acid sequence
Complementary DNA hybridize
Each spot contains known DNA Signal appears
实验流程
影响杂交反应的因素
1 探针浓度 其浓度差异对信号有影响，浓度高信 号强。 2 阳离子 阳离子存在可提高异源杂交双链的生成 速度。 3 温度 ONA25~42C，cDNA 55~70 C 4 序列组成 芯片上一次产生上万个异源杂交反应， 应选择最协调条件。 5 高灵敏度监测系统，阅读仪。
基因芯片发展历史
Southern and Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Macroarray
Hybridization of Nucleic Acids
DNA1
DNA2
RNA
Probe
Northern
Southern
hybridization hybridization
1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界 上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯 片，并制作出相应的芯片系统。此外，美国的 Hyseq公司、Aurora公司、Nanogen公司、 Incyte公司等也在积极开展DNA芯片研究工作。 近二年，摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也 相继投以巨资加入生物芯片的研究开发。
图像分析 激光扫描仪得到的扫描图像文件通过划 格，确定杂交斑点的位置，然后经过过滤背景噪音， 提取得到荧光信号强度值，最后以数据列表的形式 输出。这一系列的工作都是依靠软件来完成，如 Biodiscovery， Imagene 7.0分析软件。
Ratio值分析 在常用的双色荧光芯片系统下，各杂交斑点的
我国是从一九九七年开始对生物芯片研究。
中国医药生物技术协会生物芯片分会2006年 在北京成立。
中国在北京、上海、陕西、天津、南京建立 了五大生物芯片研发和产业化基地 。
我国生物芯片产业尚未形成统一的技术标准， 不规范。在产品认证认可方面也存在与国际 惯例不接轨的情况。
生物芯片技术是20世纪90年代以来，影响 最为深远的重大科技进展。它是继大规模 集成电路之后的又一次具有深远意义的科 学技术革命。
Types of DNA Chips
DNA Chips ExpressionChips GenomicChips SequencingChips
生物芯片的原理
生物芯片利用空间位置固定事先已知的核酸、 蛋白质、脂质和碳水化合物分子
芯片技术对固定相分子的要求较高，要求生物 分子固定在芯片基质上之后仍要保持生物活性 的稳定。
c. 环氧已基片 表面的环氧已基直接与生物分子的 氨基共价结合；
d. N-羟基琥珀酰亚胺酯片 表面的N-羟基琥珀酰亚 胺酯基直接与生物分子的氨基共价结合。
DNA Chip Technology
Solid support. glass, plastic, metal, silicon. Miniaturized array of DNA (genetic material) Work on the biochemical principle of DNA/DNA
两色荧光cy3／cy5的比值又称R/G值。一般认为R ／G值在0.5～2.0范围内的基因不存在显著表达差 异，该范围之外则认为基因的表达出现显著改变。
由于实验条件的不同，该域值范围会根据置信区 间进行调整。处理后得到的信息可以根据需要以各 种形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始匡像 拼图等。将每个信号斑点的所有相关信息如位标、 基因名称、克隆号、PCR结果、信号强度、Ratio 值等自动关联并根据需要筛选数据。
点样的方式分接触式点样与非接触式点
样两种。接触式点样是点样针直接与固相支 持物表面接触，将生物分子样品留在固相支 持物上。非接触式点样以压电原理将样品通 过毛细管直接喷至固相支持物表面。打印法 的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打 印2 500个探针；缺点是定量准确性及重现 性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。
原位合成法
原位合成法 该方法技术比较复杂，除了 Affymetrix 等少数实力雄厚的生物芯片公司 可以用该技术外，其他的公司和实验室都是 采用点样法制作芯片。 原位合成方法有两种途径，一种是原位光刻 合成，该技术是由Affymerix公司的Fodor实 验室开发。该方法的主要优点是可以用很少 的步骤合成极其大量的多肽或寡聚核苷酸阵 列。
在分子杂交反应和洗片等处理过程中能稳定结 合所亲和的分子，防止其在杂交洗涤过程中被 冲洗掉，保证检测信息的准确可靠。
芯片片基
制作芯片片基的材料首先必须有很好的光学性质，能 利用光进行透射和反射的检测
芯片表面具有可以进行化学反应的活性基团，方便生 物分子的偶联而固定
芯片表面的活性化学基团有足够的吸附能力，要能结 合最佳容量的生物分子
Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.)
Hybridization efficiency (lots of factors)
Detection technology (signal type, efficiency, noise)
> 50,000 n
sequencing expression
expressio n
genomic analysis
Sensitivity of DNA chip assays
Probe and target DNA/RNA Complexity
Chip surface (autofluorescence and non-spec. bkg)
聚类分析 clustering analysis
从生物芯片的图像分析中可得到大量的数据， 要从中提取所需要的信息就必须对这些数据的统计 分析。通过建立各种数学模型，分析芯片图像数据 的生物学意义。
聚类分析是利用大量相关数据对事物进行分类 处理，其方法为直接比较样本中各种特征数据，将 特征相近的归为一类，差别较大的归为不同的类。
Chemical synthesis
Synthesizing oligonucleotide
PROBE GGGGACGAGTCCTCCGTTCT
基因芯片分类
按芯片制备方法分类 原位合成芯片（synthetic genechip） DNA微阵列芯片（DNA microaLeabharlann Baiduray）
按探针分类 寡核苷酸阵列 DNA阵列 基因芯片 cDNA芯片 RNA芯片
一个实例
基因芯片筛选宫颈癌相关基因的研究
摘要 本研究中采用细胞原癌、抑癌基因分类芯片
对原发性宫颈癌标本进行分析，以期探讨宫颈癌 基因组中存在的癌基因表达的变异，确定与宫颈 癌相关的候选原癌或抑癌基因，为宫颈癌的诊断 和治疗提供新的线索和依据。
实验结果
1 组织总RNA制备
本实验中共收集到宫颈癌组织0.96g，正常对照宫 颈组织0.56g，分别提取总RNA。两种宫颈组织的 总RNA提取的质量见表1
芯片要有很好的稳定性，具有一定的抗压能力，并且 在生物分子杂交反应过程中要处于惰性状态，不会发 生其他化学反应或其他物质吸附
生物芯片要有很好的兼容性，可以广泛应用于生物学 检测和研究
生物分子与芯片的结合
生物芯片表面的活性基团形成特异亲和生物 分子的位点，用来吸附和固定生物活性分子， 例如多肽、核酸、酶、抗体或抗原等
芯片上每平方厘米可密集排列成千上万 个生物分子，能快速准确地检测细胞、 蛋白质、DNA及其他生物组分，并获取 样品中的有关信息，其效率是传统检测 方法的成百上千倍。
生物芯片分析过程
点阵固定 光刻合成 微量点样 喷墨
光化学检测 电化学检测
洗涤 检测扫描
试样处理 纯化、标记
基因芯片的最大优点在于其高通量。传统方 法检测众多基因要经历多次实验而且自动 化程度低，因而每次实验之间是存在系统 误差的。基因芯片可以克服这个缺点，众 多基因的探针的标记、杂交等过程是在一 次实验过程中完成的，而且自动化程度高， 数据客观可靠
生物芯片原理
principle of biochip
医学院病毒所
本章提纲
生物芯片简介 生物芯片的分类 基因芯片基本原理、流程与应用 蛋白质芯片及应用
第一节 生物芯片简介
一、 什么是生物芯片 生物芯片主要指通过平面微细加工技
术，在固体芯片等载体上的微型生物化 学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、 核酸以及其他生物组分的准确、快速、 大信息量的检测
该技术被评为1998年度世界十大科技进展 之一。
发展趋势
缩微芯片实验室 生物芯片研究领域的 一个热点，它是将传统的生物化学样品 制备、生化反应、检测三个步骤集于一 体，缩小构成芯片上的实验室系统
第二节 生物芯片的分类
一般分类
信息生物芯片和功能生物芯片
第三节基因芯片的基本原理与流程
基因芯片技术是指通过微阵列(Microarray)技术 将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合 成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻 璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助 碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及检测 等研究的技术。
四 生物芯片的制作
基本方法 点样法和原位合成法 原位合成法 原位光刻合成
压电打印法
点样法 这一方法相对技术要求不高，是最
常用的方法。点样法是将预先合成好的探 针、PCR产物、蛋白或多肽、抗原或抗体 等经纯化、定量分析后，通过由阵列复制 器或阵列点样机准确、快速地将不同探针 样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或玻片 等相应位置上，再进行固定处理，如紫外 线交联固定。
另一种原位合成是压电打印法，主要用于合成 寡聚核苷酸探针，其原理与普通的彩色喷墨打印 机相似，所用技术为常规的固相合成方法。根据 芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷 印在芯片上特定位置，冲洗、去保护、偶联等与 一般的固相合成技术相同。
该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成 一致，不需要特殊制备的化学试剂，可以合成出 长度为40～50个碱基的探针。
根据芯片基片表面的活性基团的类型，芯片 可以分为氨基片、醛基片、环氧乙基片和N 一羟基琥珀酰亚胺酯片
根据不同的需要来选用芯片，如对大分子 DNA的吸附要用氨基片，对寡聚核苷梭或 小片段DNA要用醛基片
a. 氨基片 表面为氨基，直接与核酸分子的磷酸基团靠 电荷作用相结合
b. 醛基片 表面的醛基直接与生物分子的氨基共价结合
表1 总RNA提取结果
样品类型 标记
编号 总RNA量 OD260 OD280 OD260/OD280 荧光