原生质体培养和再生渗透压稳定剂变化

原生质体培养和再生渗透压稳定剂变化
问题：原生质体的培养过程是怎么样的？为什么用甘露醇作渗透压
调节试剂？再生细胞壁后为什么要降低渗透压？
原生质体的分离和纯化
原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。

1.分离方法
（1）机械法分离：缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力；（2）酶法分离：C o c k i n g最早开展这方面研究，克服了机械法分
离的缺陷，可分为直接法和顺序法两种。

酶法可在短时间内获得大量原生质体，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用。

2.影响原生质体分离的因素（酶法）
从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体。

但是对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。

原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。

（1）外植体来源
生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。

用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物、原球茎、花瓣和叶表皮等。

叶肉细胞是常用的材料，叶片很易获得而且能充分供应。

取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。

另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒。

选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。

一般在继代后的第三天游离原生质体。

（2）酶液组成和浓度
植物细胞壁由三个主要成分构成：纤维素，壁干重的25-50%，半纤素，平均53%，果胶质，5%用来分离植物原生质体的酶制剂主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和离析酶等，酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶。

纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶的作用是降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开。

（3）渗透压
原生质体操作需要在一定渗透压存在下进行，常用的配制分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为C P W液（清洗剂）。

多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及扩散入原生质体的速度很慢的缘故，这样一来能保证一个稳定的渗透压。

（4）分离培养基
钙、镁离子很重要，有时需要激素，P V P有时能增加原生质体产量。

分离原生质体的培养基用量一般为10m g/g组织。

（5）培养条件
主要的是酶处理时的温度和p H。

不同的酶需要的p H值不一样，但p H 大于6时不利于原生质体生存。

一般而言，分离原生质体的培养时间与温度成反比，可是高温下短时间分离的原生质体不适于培养，他们易发褐和破裂。

但酶处理时间一般不超过24小时。

一般常用温度是23-32℃。

酶处理时一般在暗处培养。

叶片分离原生质体可在静置条件下进行，悬浮细胞由于壁厚，培养（分离）过程中间断低速震荡有利于酶渗透。

4.原生质体的收集、纯化
经酶解处理后，得到的混合物是一个由原生质体、细胞团与细胞碎片等组成的混合液，只有将杂质和酶液去掉，使原生质体纯化，才能进行培养。

（1）收集
原生质体混合液用滤网（40-100µm）去掉没有降解的细胞及组织，收集滤液。

（2）洗涤
将网下物低速离心，去掉上清液,再加无酶液的C P W液悬起原生质体，再离心，弃上清，重复几次即可。

（3）纯化
采用上浮法和下沉法两种纯化方法。

上浮法是将酶解的原生质体与蔗
糖溶液（23%左右）混合，下沉法是先将原生质体与13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。

两种方法中，均在100×g下离心5-10分钟，会在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。

用吸管将带轻轻地吸出来，用培养基悬浮离心，然后稀释到104-105
个/m l，用于培养。

1.培养基
M S＋N A A 2.0p p m＋B A0.5p p m＋3％蔗糖＋9％甘露醇
注意：
（1）原生质体分离后，非常脆弱，需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成。

（2）针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。

2.影响原生质体培养的因素
营养需求（N H4＋不能过多），渗压剂，培养密度（105/m L），贮藏条件（通常在黑暗处）。

3.培养方法
液体基质培养法，半液体基质培养法，固体基质培养法，看护培养。

4.固体培养的步骤
原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖（40℃）的培养基混和→倒转培养皿在25℃下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养，培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱导分化成植物的根，茎。

1．细胞再生
（1）细胞壁的形成
原生质体培养后经过一段时间会再生出细胞壁，原生质体在培养初期仍然为圆球形，随着培养时间的延长，逐渐变为椭圆形，此时表明已经开始再生细胞壁。

不同植物原生质体培养再生细胞壁所需时间不一样，从几小时到几天。

简单的鉴别壁的再生的方法是用荧光增白剂，专染纤维素,在荧光灯下发出荧光。

一些因素影响壁的再生：①碳源；②培养条件——固体培养时细胞壁再生比液体培养时快；③渗透剂的种类。

（2）细胞分裂
第一次分裂通常发生在培养后2-5天，可在黑麦中需14天。

4．植株再生
具有再生能力的原生质体就会不断分裂，形成多细胞团。

当细胞团进一步发育成为肉眼可见的小愈伤组织，要及时转移到分化培养基中，培养与再生过程同一般的愈伤组织培养。

试题：在植物的细胞培养中，有多种方法可提取原生质体。

原生质体的分离与培养成功解决了植物组织培养、植物克隆等方面的难题，标志着植物细胞工程技术向前迈进了一大步。

以下说法正确的是（）A．提取原生质体唯一有效的办法是酶解法
B．把原生质体放入高渗溶液中，可正常膨大
C．通过原生质体融合再生植株可克服远缘杂交的不亲和性，但不是遗传转化的理想受体
D．原生质体的获得再一次证明植物细胞质壁分离现象的存在
答案：D
分析：提取原生质体唯一有效的办法是酶解法是错的，还有机械处理等方法，A错误；把原生质体放入高渗溶液中，会失水缩小，B错误；通过原生质体融合再生植株可克服远缘杂交的不亲和性，但它也是遗传转化的理想受体，所以C错；原生质体的获得再一次证明植物细胞质壁分离现象的存在，原生质体的外界面是细胞膜，D正确。