实验五十 动物病毒的鸡胚培养

实验五十一动物病毒的鸡胚培养
三、器材
1．病毒痘苗病毒（Vaccinia virus），鸡新城疫病毒（Newcastle distase virus）。

2.仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2.5％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加1／4凡士林，溶化），灭菌培养板，灭菌盖玻片等。

3.白壳受精卵（自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好）。

四、操作步骤
1．准备蛋胚
孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45%~60%），孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。

孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。

活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。

生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。

鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供应不足，会导致鸡胚大量死亡。

2.接种
（1）绒毛尿囊膜接种
①将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。

②用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5~6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。

在气室顶端钻一小孔。

③用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜分离。

④用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室（图Ⅻ—4）。

⑤用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0.05~0.1ml痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。

⑥在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。

也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。

将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48~96h观察结果。

温度对痘苗病毒病灶的形成影响显著，应严格控制培养温度在37℃，高于40℃的培养温度，鸡胚不能产生典型病灶。

（2）尿囊腔接种用孵育10~12d的蛋胚，因这是尿囊液积存得最多。

①将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出其实与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方做记号。

②将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。

用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。

③用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0.1ml病毒液（图Ⅻ—5）。

④用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72h。

（3）羊膜腔接种
①将孵育10~11d的蛋胚照视，画出气室范围并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。

②用碘酒消毒气室部位的蛋壳。

用齿钻在气室顶端磨一三角形，每边约1cm的裂痕。

注意
勿划破壳膜。

③用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察，若将蛋胚放在检卵灯上，则看得更清楚。

④用灭菌尖头镊子，两页并拢，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来（图Ⅻ—6）。

⑤左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜，右手持带有26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入鸡新城疫病毒液0.1ml针头最好用无斜削尖端的钝头，以免刺伤胚胎。

⑥用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48~72h，保持蛋胚的钝端朝上。

鸡胚接种病毒的操作过程及使用器械应严格无菌，尽可能在无菌工作台上进行。

3.收获
（1）绒毛尿囊膜
①用碘酒消毒人工气室上卵壳，去除窗孔上的盖子。

②将灭菌剪子插入窗内，沿人工气室的界限剪去壳膜，露出绒毛尿囊膜，再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起，用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐的培养板内，观察病灶形状。

然后或用于传代，或用50%甘油保存。

（2）尿囊腔接种法收获尿囊液
①将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。

②用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。

切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。

③将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液，一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液，收获的尿囊液暂贮4O C冰箱，经无菌试验合格后于-30O C长期贮存。

收获尿囊液时均勿损伤血管，否则病毒会吸附在红细胞上，使病毒滴度显著下降。

④观察鸡胚，看有无典型的症状。

（3）羊膜腔接种法收获羊水
①按收获尿囊液的方法消毒、去壳，翻开壳膜和尿囊膜。

②先吸出尿囊液。

③再用镊子夹出羊膜，以尖头毛细吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入灭菌试管内，每蛋胚可吸0.5~1.0ml。

经无菌试验合格后，保存于低温中。

④观察鸡胚的症状。

五、试验报告
1.结果
（1）描写痘苗病毒在鸡胚绒毛尿囊膜上培养后，所出现的病变状况。

（2）描写鸡新城疫病毒接种鸡胚培养后，鸡胚所出现的变化。

2.思考题
（1）本实验所用的两种病毒，储能在鸡胚中进行培养外，还能用哪些方法进行培养？试比较它们的优缺点。

（2）接病毒后的鸡胚常出现非特异性的意外死亡和病毒感染引起的特异性死亡，如何判定死亡原因？
实验五十二昆虫病毒的培养
一、目的要求
1.学习用感染宿主的方式培养昆虫病毒的基本方法。

2.观察核型多角体的形态。

二、基本原理
昆虫病毒是以昆虫为宿主的病毒，与宿主的特异性高。

研究昆虫病毒的重要目的是保护益虫和杀灭害虫。

例如蚕遭到病毒的侵害会造成巨大的经济损失，因此，研究与杀灭这些病毒，对防治与控制蚕病从而达到保护蚕业生产有重要价值；另方面对农林作物有害的昆虫，又要利用其特异病毒作为杀灭害虫的手段。

培养昆虫病毒主要采取组织培养和感染宿主两种方法，后者比较容易成功，使用更为广泛。

本实验以斜纹夜蛾（Prodenialitura）核型多角体宿主来培养病毒。

斜纹夜蛾能危害棉花、蔬菜等多种作物。

核型多角体病毒是多角体病毒侵入宿主细胞后，在细胞核内形成多角体，多角体内包含着很多病毒粒子。

斜纹夜蛾多角体的形状有三角形、四角形、五角形、六角形和圆形，直径大小在 1.2~3.4µg，用普通显微镜可观察到。

多角体蛋白可被碱性溶液溶解，而释放出病毒粒子。

因此，多角体通过污染食物经口感染后，被昆虫的碱性胃液所溶解，释放的病毒粒子通过中肠上皮组织而进入血腔，在脂肪组织及其他组织（包括血细胞）中增殖。

斜纹夜蛾感染病毒后明显的特征是体色变化，30O C下感染后3d 左右幼虫腹面体色由正常的绿色变为粉红色。

发病后期，食欲减退，死亡前半天到一天，停止摄食，排稀粪，幼虫常向上爬行，在自然界常倒悬或附着于枝叶上而死亡。

在病毒大量繁殖后，血液中出现大量多角体，通过皮肤可以看到血液呈混浊状，此时皮肤脆弱易破，有时前腹背后端破裂，流出乳白色货稍带粉红色液体，似脓汁，具有很强的感染性。

三、器材
1.病毒材料及宿主斜纹夜蛾核型多角体病毒材料（保存于冰箱的虫尸），三龄斜纹夜蛾幼虫。

2.仪器或其他用具蓖麻或甘薯叶片，1%漂白粉或5%石灰水，甘油，玻璃缸，纱布，血细胞计数板，显微镜，离心机等。

四、操作步骤
1.病毒悬液制备
（1）将斜纹夜蛾核型多角体病毒材料加适量蒸馏水置研钵中研磨，加水稀释并通过两层纱布过滤，再将滤液离心（3000r/min离心30min）。

（2）将离心后的沉淀物用蒸馏水悬浮，并再离心，这样反复多次，即可得到初步提纯的白色多角体。

（3）将提纯的多角体先用适量的蒸馏水均匀悬浮，并用血细胞计数板计数，然后再加水稀释成每毫升1X108个多角体的悬液。

（4）向上述悬液中加入每毫升含青、链霉素各1500~2000单位，以防止杂菌污染。

2.接种
（1）将由田间采来的健康三龄斜纹夜蛾幼虫放于玻璃缸内，缸口用多层纱布盖好。

虫口密度一般在33mm2一头左右为宜。

（2）用1%的漂白粉液或5%石灰水浸泡蓖麻或甘薯叶片进行消毒，然后再用清水洗涤，晾干后，用上述核型多角体悬液浸泡或用蘸有多角体悬液的棉球涂抹，晾干。

（3）待幼虫经短时间的饥饿以后，将晾干的带毒叶片放于玻璃缸内供食，通过幼虫口食接种病毒。

供食带毒叶片的次数可为1~3次，一般供毒次数多则发病率高。

盖好纱布后，置30O C温室培养。

（4）培养过程仍需喂食，加强管理与观察。

3.收获与保存
（1）在幼虫死亡前，虫体变白，通过皮肤看到血液混浊时，在尾角或腹脚处剪破，收获脓汁，保存于甘油水溶液（水：甘油=1:2）中，置冰箱保存。

（2）或将脓汁经洗涤、离心，取多角体沉淀加乳糖制成糊状，冷冻干燥保存。

（3）若整个死虫保存，则将未放出脓汁的病死虫直接放甘油水溶液中，冰箱保存。

4.涂片镜检
（1）从尾角或腹脚取血涂片，加上盖玻片。

（2）于（600X）高倍镜下观察。

五、实验报告
1.结果
（1）绘图表示显微镜下观察到的多角体形态。

（2）描写斜纹夜蛾幼虫感染斜纹夜蛾核型多角体后，体表的变化。

2.思考题
（1）学会对昆虫病毒的培养，对农作物病虫害的防治有什么意义？
（2）用昆虫病毒进行害虫的防治，对人、畜和其他有益昆虫有无危害？为什么？
（3）如果某项研究或实际工作要求你从自然环境中分离高毒效的斜纹夜蛾核型多面体病毒，你将到什么地方？用什么材料进行分离，请写出简单的实际方案。

实验五十三动物病毒毒力测定
一、目的要求
1、学习用培养细胞单层测定病毒毒力的基本方法。

2、掌握病毒半数细胞培养物感染剂量的测定技术及计算方法。

二、基本原理
病毒感染能力测定是评估其毒力的常用方法之一。

通常采用测定实验动物的半数致死量（50% lethal dose,LD50）和测定细胞培养物的半数组织（细胞）培养物感染量（50%tissue culture infectious does, TCID50）来评估病毒的感染能力（毒力）。

用细胞培养物测定病毒的TCID50较实验动物的LD50简便、经济，且易控制实验条件，加之细胞系的同质性高，敏感性比较一致，没有个体间的遗传差异。

所以本实验介绍的TCID50测定方法。

溶细胞性病毒的毒力与其致细胞病变的能力直接相关，固可用不同含量的病毒液接种敏感的宿主细胞培养物测定毒力。

实验中病毒的毒力以其致细胞病变效应（cytopathic effect CPE）的程度确定，即观察病毒致细胞病变的最高和最低值，以半数细胞病变为病毒感染剂量。

然而，实验中所能观察到的是不同稀释病毒致细胞病变的定性结果，需要将结果统计处里，用Reed-Muench公式计算，才能获得病毒TCID50的相对定量（滴度或效价）。

为了便于理解，以一病毒致细胞病变的观察结果，介绍Reed-Muench公式的计算方法。

首先获得表Ⅻ-2的观察结果：
从表中可见，该病毒的TCID50在10-3和10-4稀释度之间。

表Ⅻ-2 病毒CPE观察结果
根据Reed-Muench公式“TCID50=高于50%CPE百分率病毒稀释度的对数+比距×稀释因
子的对数”（1）式中，比距=
50%CPE50
50%CPE50%CPE
高于百分率－
高于百分率－低于百分率
(2)，将表Ⅻ
-2的数值代入（2）式中，则比距=91.650
91.640
－
－
=0.8。

再将比距值代入（1）式中，㏒10-3+0.8
×㏒10-1=-3.8，则㏒TCID50=-3.8，即TCID50=10-3.8。

查反对数得6310，即该病毒6310倍稀释度0.1ml等于1个TCID50。

三、器材
1.病毒及宿主甲型流感病毒（influenza virus A），传代犬肾细胞系MDCK（Canis
familiaris）。

2.培养基DMEM细胞培养液（含10%小牛血清，100µg/ml的青、链霉素）。

3.溶液或试剂0.25%胰酶液，0.1mol/L，磷酸缓冲液（PBS,pH 7.2）。

4.仪器或其他用具96孔细胞培养板，10~200µl可调试加样器，无菌小试管，血细胞
计数器，倒置显微镜，普通显微镜，CO2培养箱。

四、操作步骤
1.MDCK细胞培养
常规复苏液氮冻存的MDCK细胞，接种于培养方瓶中，加入7~10mlDMEM培养液，充分混匀，置37O C培养2~3d，待细胞形成致密单层备用。

2.细胞悬液制备
MDCK单层细胞一瓶，弃上清夜，加0.25%胰酶1ml，37O C消化2~5min，待细胞完全脱壁后加入3mlDMEM培养液，充分分散细胞。

取样显微计数，调整细胞浓度为2×105~5×105/ml。

胰酶消化时间不宜过长，否则对细胞造成损伤。

初学者可将细胞培养瓶置显微镜下观察，细胞变圆脱壁即可。

3.细胞接种
取96孔塑料细胞培养板一块，用加样器分别向每孔加入细胞悬浮液200µl。

4.细胞培养板置37O C，5%CO2的培养箱中培养24h，细胞快速生长，形成70%左右的单层可用于病毒接种。

5.病毒稀释
将病毒液在5ml无菌试管内作连续10倍稀释，即用1ml吸管吸取0.2ml病毒液，加到装有1.8mlPBS的第1支小试管内（10-1），充分混匀后，更换吸管，吸取0.2ml加入第2管中，连续如此操作，继续第3支稀释，如此类推，稀释到第6管（10-6）.
病毒液中务必加少量胰酶（2.5µg/ml），增强病毒的吸附力。

6.病毒感染
从CO2培养箱中取出96孔细胞板，弃上清液，用PBS洗2次，于每孔加入不同稀释度的病毒100µl，每稀释度重复8孔。

对照组以100µlPB S代替病毒液，然后每孔补加新鲜的DMEM培养液100µl，总体积为200µl。

7.观察
细胞培养板置37O C，5%CO2培养箱中继续培养。

逐日用倒置显微镜观察细胞病变情况，至少观察一周。

五、实验报告
1.结果
记录观察细胞病变（CPE）的结果于下表中：
2.按Reed-Muench公式计算流感病毒的TCID50效价。

3.思考题
（1）根据你的实验结果，你认为影响病毒TCID50测定准确性的因素有哪些？
（2）噬菌体效价测定和动物病毒TCID50测定原理是否相同？为什么？
（3）TCID50测定是评估病毒毒力的一种常用方法，它是否适用于任何一种病毒，为什么？
五十补充
噬菌体效价=pfu数X稀释倍数X10
此处是图
五、实验报告
1．结果
（1）记录平板中每稀释度的pfu数于下表中：
（2）你测得的噬菌体效价是多少？
2．思考题
（1）什么因素决定噬菌斑的大小？
（2）测定噬菌体的效价，操作时要注意些什么才能测定准确？
（3）计算噬菌体效价时，选择30~300个pfu的平板计数较好，为什么？
（4）如果在你的测定平板上，偶尔出现其他细菌的菌落，是否影响你的噬菌体效价测定？。