生化实验讲义(10个)教学内容

生物化学实验讲义

赵

国

芬

2010年9月

实验之前说明

1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实

验的方法,同时开出不同的10个实验.

2.共开出10个不同的实验

实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响

实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定

实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法

实验四双缩脲测定蛋白质的含量

实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定

实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用

实验八植物组织中维生素C的定量测定

实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察

实验十植物组织中DNA的提取和鉴定

3.穿着要利索,做好实验记录

4.注意实验室卫生和安全.

一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解.

二. 生物化学所用的实验技术

1.样品: :血液、血浆、血清、组织

植物样品：果实、花蕾、茎等

无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆

2．移液管的使用：

移液管吸管

移液管

奥氏吸管

读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。

3．离心机的使用：

平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停

4．分光光度计

机器原理和测定原理（比尔定律）

5．水浴锅的使用

三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写）

目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论

实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响

一、实验目的

通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。

二、实验原理

酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。

本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。

淀粉被酶水解的变化，可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。

三、试剂

1.0.5%淀粉溶液

2.碘化钾－碘溶液

3.1%尿素溶液。

4.1%CuSO4溶液

5.磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0:

6.0.5%NaCl溶液。

7.唾液淀粉酶制备每人用自来水漱口3次，然后取20m1蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液lOml，稀释至2Oml为稀释唾液，供实验用。

四、操作步骤

一、温度对酶活性的影响

（一）淀粉酶的观察

1、取3支大试管，编号后按表操作

2、在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应

液1滴与碘混合，观察颜色变化。

3、待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化（即只呈碘的颜色）时，向各管中加入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，说明温度对酶活性的影响。

结果与分析：

结果：各管颜色

分析：为什么

比如：

结果与分析：

1号中为兰色，2号为无色，3号为兰色

说明37℃为淀粉酶的活性最高的温度，淀粉水解的速度最快，其它2个温度淀粉酶的活性低，淀粉几乎没有水解。

二、pH对酶活性的影响

1、取试管1支，加入pH6.8的磷酸缓冲溶液3m1、0.5%淀粉溶液2ml，混匀。放置于37℃水浴中保温3分钟。再加入稀释唾液2ml，混匀，继续保温，每隔l 分钟取出1滴于白瓷板上，加碘液1滴，观察淀粉水解的程度，直至碘不变色，记下保温时间。

2、另取试管5支，编号，按编号顺序分别加入pH5.0、 6.2、6.8、7.4、8.0的磷酸盐—柠檬酸缓冲溶液3m1，每管加入0.2%淀粉溶液2m1。置37℃水浴中保温3分钟后，以1分钟的间隔，依次向1-5号试管中加入稀释唾液2m1，摇匀，37℃水浴中保温。参照上述第一步实验的保温时间，到时迅速取出，并立即加入碘液2滴，充分摇匀，观察各管呈现的颜色，判断在不同pH条件下淀粉的水解的程度。可以看出pH对唾液淀粉酶活性的影响，并确定最适pH。

结果与分析：

结果：各管颜色

分析：为什么

三、酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响

1.取小试管3支，按表操作

2.将3支试管放入37℃水浴中，并在白色比色板上用碘液检查第二管，待碘液

不变色时，向各管中加碘液1滴，观察水解情况，记录并解释结果。

结果与分析：

结果：各管颜色

分析：为什么

实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定

一、实验目的学习从牛奶中制备酪蛋白的方法并进行鉴定试验

二、实验原理

牛乳和羊乳中含丰富的蛋白质，其中主要是酪蛋白。酪蛋白在其等电点pH溶液中溶解度降低。所以，将牛乳的pH调整至4.8，即酪蛋白的等电点时，酪蛋白即沉淀出来。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到纯的酪蛋白。所得酪蛋白供定性鉴定。

除去酪蛋白的滤液中，尚含有球蛋白、清蛋白等多种蛋白质。

三、试剂

1.醋酸钠缓冲液 (0.2mol/LpH4.6)

2.米伦(Millon)试剂

3.95%乙醇。

4.乙醚。

5.1O%NaCl

6.0.5%Na2C03。

7.0.lmol/LNaOH。

8.0.2%HCl

9. 饱和氢氧化钙 (Ca(OH)2)。

10. 5%醋酸铅。

四、实验操作

(一)酪蛋白的制备取新鲜牛乳2Oml，放人100ml烧杯中加热至40℃。加入2Oml 加热至同样温度的醋酸缓冲液，一边加一边摇动，并用pH计检测，调整混合液的pH为4.8（实际中准确加入牛奶与醋酸缓冲液体积相同时，可以不用调节pH）。冷却至室温，继续放置5分钟，然后将溶液转入离心管中离心3000r/min，时间5分钟（注意离心时要对角配平），离心后清液保留做鉴定实验。所得沉淀物悬浮在约30ml等量的醇醚混合液中，搅匀，离心3000r/min，时间5分钟，弃清液，所得沉淀摊在表面皿上，使醇醚混合液挥发。

（二）酪蛋白的性质鉴定

1.溶解度取试管6支，分别加入水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L 氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙溶液各2m1。于每管中加入少量酪蛋白。不断摇荡，观察记录各管中的酪蛋白溶解度。

2.米伦反应取酪蛋白少许，放置于试管中。加入lml蒸馏水，再加入米伦试剂10滴，振摇，并徐徐加热。观察其颜色变化。

3.含硫 (胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)测定:取少量酪蛋白溶于lmlO.1 mol/L 氢氧化钠溶液中，再加入1-3滴5%醋酸铅，加热煮沸，溶液变为黑色。

(三)乳清中可凝固性蛋白质的鉴定将制备酪蛋白时所得的清液移入烧杯中，徐徐加热。即出现蛋白质沉淀。此为乳清中的球蛋白和清蛋白。

实验三、血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法

一、实验目的学习并掌握福林-吴宪氏法测定血液中葡萄糖的方法

二、实验原理