转基因植物的筛选与检测

曝光显影后的条带
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• 总结：这些技术需要转膜、杂交，操作繁 琐，费用高,可对转基因植株随机取样检测。 • Southern 杂交特异性强，确定转基因植株 中基因的存在、整合及稳定性，是检测外 源基因的最可靠的方法。 • Western杂交灵敏度高，能检测出蛋白质表 达量，最具有现实意义。
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谢谢大家！
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• Northern 杂交的主要原理是把变性 RNA 转移和固定在特定的薄膜上 , 用特定的 DNA 探针来检测 RNA。 • 特点：
Northern 杂交与Southern 杂交相比 , 更接近于性 状表现 , 更有现实意义 , 被广泛用于转基因植株 的检测。但RNA 提取条件严格 , 在材料内含量少 , 不适于大批量样品的检测。
转基因植物的筛选与检测
转基因植物的筛选与检测
• 问题 • 1.进行转基因操作了，如何选出来已成功 导入基因的细胞？ • 2. 转化体里的外源基因是否成功的表达了 呢？
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一、筛选的方法与原理
• 通过特定基因在转化体内的表达，利用特 定的试剂，选择出来转化细胞。
• 注： 1.特定基因又称“抗性基因” 2.表达方式：蛋白质的合成、酶的失活等
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• Southern 印迹杂交是利用标记的探针 （probe）与膜上靶DNA片段进行杂交的技 术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同 源的序列。 • 特点：
可清除操作过程中的污染 (如 DNA 分离及植物 DNA 分离过程中的交叉污染) ，以及转化愈伤胞 间质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高。 Southern 杂交程序复杂，成本高 ，且对实验技术 条件要求较高。
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Southern杂交
• • • • • • • 1.提取DNA 2.电泳 3.变性 转移 DNA 印迹 4.转膜 5.固定DNA 6.探针的标记 7.杂交与检测（NBT/BCIP显色）
膜
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Southern杂交
把膜和胶片紧密结合，压！
转膜仪
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转膜
变性 转移
双链DNA
单链DNA
固相支持物
电泳槽、缓冲液、夹板
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• Western 印迹是将蛋白质从 SDS-PAGE胶 中电泳转移至固相支持体上 , 然后对固定化 蛋白质进行免疫学测定的方法。 • 特点：
Western 杂交灵敏度极高，可以测出粗蛋白提取 物中小于 50ng 抗原，在较纯的制剂中 ，可测出 1～5ng 抗原。能直接显示目的基因在转化体中 是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的 性状表现。
表“植物遗传转化中的选择试剂及其抗性基因”
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二、检测的方法与原理
• 利用特定基因在转化体内的表达，对其表 达产物进行检测。
• 不同分子水平上检测方法：
Southern PCR
Northern
qRT-PCR
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Western
• 报告基因(reporter gene)是一种编码可被检 测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一 个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 • 必须具有以下几个条件：
(1)已被克隆和全序列已测定； (2)表达产物在受体细胞中原本不存在； (3)其表达产物能进行定量测定。 例如：Kan 抗性基因、Gus 基因、Bar 基因
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• Gus基因存在于E.coli等一些细菌基因组内， 编码β-葡萄糖苷酸酶。 • 缺点：
（1）染色不均匀 （2）不能进行亚细胞定位 （3）不能进行活体染色
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• PCR/qRT-PCR 是在体外快速特异地扩增目 的基因DNA片段的有效方法。 • 特点：
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 ，染色后很容易观察， 不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺 序。材料用量少，检测方便，可以在试管苗阶段， 甚至对愈伤组织进行检测，了解转化早期的信息， 便于及时优化试验方案。DNA提取方便，适合于 大批量样品分析，又能检测目的基因的完整性， 是早期检测的一种较好方法。
• 注意： • 此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不 变。故而称为印迹（blotting）。 • 用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素 膜（NC膜）、尼龙膜（Nylon） 、化学活化膜和 滤纸等。
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Western
• • • • • • 1.制胶及上样 2.电泳 3.转膜 4.封闭 5.抗体孵育 6.曝光显影