简述基因治疗及其基因传递载体的应用

简述基因治疗及其基因传递载体的应用

1 基因治疗机理

基因治疗是二十世纪九十年代发展起来的一种全新的疾病治疗模式，是通过载体将外源基因、基因片断或者寡聚核昔酸引入受感染的细胞内进行适当的表达，以纠正或改善致病基因所产生的缺陷，达到治疗疾病的目的。从广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物，治疗疾病的一种方法。从狭义地说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改善疾病的一种治疗手段。基因治疗是一种根本性的治疗，它可以通过取代突变的致病基因，也可以通过改变病变细胞的基因结构，或者通过导入能增强人体内免疫能力的基因等方式，来达到治疗的目的。与传统的药物治疗相比，基因治疗从根本上实现对疾病的控制。1990年，美国国立卫生研究院实施了第一例人类基因治疗，对两例ADA缺乏症的女性患儿进行了ADA基因转移，从此开创了人类基因治疗的先河。10多年来，基因治疗的发展历史曲折，虽然有成功的报道，但从总体上看，仍处于试验阶段，尚未达到理想的疗效。

2 基因治疗途径及步骤

基因治疗主要有体外和体内两种途径。体外途径指通过选择适当的靶细胞，在体外进行基因转移，筛选可表达外源基因的细胞，再将这些细胞转移至体内。这是基因治疗前期最常用的方法，其优点在于可将细胞移植回体内前，可以对细胞进行检查和优化，易于操作；而且细胞在

扩增过程中，对外源的添加物质大量稀释，易于清除；同时，人体细胞，尤其是自体细胞，加工后应用于人体自身，易于解决安全性问题。但该方法仅局限于可移植细胞，如淋巴细胞和骨髓细胞等，同时仍需对可能发生的免疫反应进行检查。该方法的另一缺陷是面临着如何长期保持移植细胞功效的问题及细胞移植回体内后其基因表达关闭，必需开发和寻找合适的启动子。另外，这种方法在工业化方面，载体系统不易形成规模，而且必须有固定的临床基地。

体内途径则是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接的将治疗基因导入患者体内。这种方式的导入，无疑有利于大规模工业化生产。但是，对这种方式导入的治疗基因及其载体必须证明安全性，而且导入体内后必须能够进入靶细胞，有效地表达并达到治疗目的。因此，在技术上要求很高，其难度明显高于体外途径。目前，对其研究日益增多，可能将成为基因治疗最有前途的方法。

基因治疗步骤：⑴选择治疗基因；主要是依据病因和发病学选定，对于某一种疾病治疗基因可以有多种，可通过优化组合来确定，这将有赖于人类基因组计划，尤其是功能基因组学的发展。⑵选择治疗基因导入系统（包括基因转移载体和基因导入途径）；是基因治疗的核心技术，是基因治疗是否能够进入临床和获得疗效的关键，因而始终是基因治疗的重点和难点。⑶治疗基因的表达。治疗基因、基因传递系统和基因表达系统是构成基因治疗药物的三个组成部分。

3基因治疗的原则

将治疗性基因以一定的方式高效导入所需部位，并使之在靶细胞中适时适量表达，从而达到治疗疾病的目的，这是最理想的基因治疗模式。其中有几个关键问题：首先是必须分离出含有调节序列的特异性基因；其次是必须能够获得足够数量携带该基因的载体或/和细胞；第三

必须建立一条有效的途径将该外源基因导入体内、转染靶细胞；最后转染入宿主细胞的目的的基因必须能产生足够量的产物，可维持适当长的时间，且不产生有害的副作用。简言之，导入体内基因要特异、稳定、高效、安全并具有可调控性。

3.1目的基因的选择

用于基因治疗的目的基因选择原则为:(1)该基因的异常是疾病发生的根源；(2)该基因遗传的分子机制清楚；(3)基因已被克隆，一级结构和表达调控机制较为清楚；(4)可在体外操作，而且安全有效；(5)转移基因在受体细胞内最好能够完整地、稳定地整合并能适时适量表达功能性蛋白质。基因治疗中选择的目的基因可以来自染色体基因组。也可以来自互补DNA ( complementary DNA,cDNA)。目前基因治疗研究中所应用的目的基因多数是通过cDNA克隆技术得到的。以恶性肿瘤为例，在基因治疗方案中，所用的基因大致可归为三类：一是细胞因子类；二是杀伤性基因类，以疱疹病毒I型胸苷嘧啶激酶(HSV-tk)为代表；三是以

P53为代表的抑癌基因或癌基因的反义基因类。

3.2受体细胞的选择

基因治疗选择受体细胞的原则为：(1)最好选择组织特异性细胞，即外源基因仅在该系统组织中表达，而在其它组织中不表达或表达水平较低；(2)细胞要易于从体内取出，有增殖趋势，且生命周期较长，使有足够的时间进行体外基因操作；(3)离体的细胞要能接受外源基因的转染；

(4)细胞经过体外基因操作后能够存活下来，并能安全输送回体内。根据疾病的性质、基因治疗的策略，靶细胞可以选择外周血淋巴细胞、骨髓造血干细胞、成肌细胞、成纤维细胞、角质细胞、呼吸道上皮细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞和神经胶质细胞等。

3.3基因表达载体的选择

目的基因本身一般不含有启动子等调控序列，导入靶细胞后很难得到目的基因的表达。因此，必须将目的基因重组于表达载体的合适位

置，再导入细胞，在特定调控序列指导下进行表达。表达载体有质粒载体(plasmid vector)和病毒载体(viral vector)两大类。质粒载体一般可用物理、化学以及融合法导入靶细胞。为了便于操作，构建的质粒载体不仅包含哺乳动物细胞的表达调控元件，而且也包含了细菌内进行复制的表达元件，因此被称为穿梭载体(shuttle vector )。目前被广泛应用于哺乳动物的质粒载体有pSV2, pRSV, pcDNA3和pCI载体系列等。这类载体的特点是可插入较大长度的外源基因(10kb以上)，有较为广泛的宿主细胞范围，经转染的细胞不发生裂解，故可建立稳定分泌外源蛋白的细胞株，用于ex vivo基因转移。上述载体随着采用的调控序列不同，其表达的效率也不同。病毒载体的构建与质粒载体相似，但进入靶细胞的方式不同。目的基因与病毒载体重组形成重组载体。在基因治疗中多是将此重组载体以不同方式进行包装，获得重组的病毒颗粒，再感染靶细胞，以便将目的基因带入靶细胞，并得到目的基因的表达。

4基因治疗中有待解决的关键问题

基因治疗是一种富有前景的治疗疾病的方法。然而，人类疾病基因治疗的限制主要是转基因方法的潜在风险，相对低效率和靶基因的细胞内稳定性。因此，基因治疗作为一种崭新的治疗手段要想应用于临床，那么就必须解决几个关键的问题。

4.1基因转染系统的安全性

基因治疗从实验室走向临床面临的第一个问题就是缺乏完善的基因转移载体系统。众所周知，对临床基因治疗而言，安全性尤为重要。1999年患者Jesse Gelsinger 的死亡，为基因治疗抹上了一层阴影。德国的华人科学家及其同事在用反转录病毒基因标记的动物模型中率先观察到白血病诱导作用，2002年法国基因治疗小组在为一名X染色体连锁的严重联合免疫缺陷性疾病(X-SCID )患者进行临床基因治疗试验后，又