简述基因治疗及其基因传递载体的应用

简述基因治疗及其基因传递载体的应用

1 基因治疗机理

基因治疗是二十世纪九十年代发展起来的一种全新的疾病治疗模式，是通过载体将外源基因、基因片断或者寡聚核昔酸引入受感染的细胞内进行适当的表达，以纠正或改善致病基因所产生的缺陷，达到治疗疾病的目的。从广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物，治疗疾病的一种方法。从狭义地说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改善疾病的一种治疗手段。基因治疗是一种根本性的治疗，它可以通过取代突变的致病基因，也可以通过改变病变细胞的基因结构，或者通过导入能增强人体内免疫能力的基因等方式，来达到治疗的目的。与传统的药物治疗相比，基因治疗从根本上实现对疾病的控制。1990年，美国国立卫生研究院实施了第一例人类基因治疗，对两例ADA缺乏症的女性患儿进行了ADA基因转移，从此开创了人类基因治疗的先河。10多年来，基因治疗的发展历史曲折，虽然有成功的报道，但从总体上看，仍处于试验阶段，尚未达到理想的疗效。

2 基因治疗途径及步骤

基因治疗主要有体外和体内两种途径。体外途径指通过选择适当的靶细胞，在体外进行基因转移，筛选可表达外源基因的细胞，再将这些细胞转移至体内。这是基因治疗前期最常用的方法，其优点在于可将细胞移植回体内前，可以对细胞进行检查和优化，易于操作；而且细胞在

扩增过程中，对外源的添加物质大量稀释，易于清除；同时，人体细胞，尤其是自体细胞，加工后应用于人体自身，易于解决安全性问题。但该方法仅局限于可移植细胞，如淋巴细胞和骨髓细胞等，同时仍需对可能发生的免疫反应进行检查。该方法的另一缺陷是面临着如何长期保持移植细胞功效的问题及细胞移植回体内后其基因表达关闭，必需开发和寻找合适的启动子。另外，这种方法在工业化方面，载体系统不易形成规模，而且必须有固定的临床基地。

体内途径则是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接的将治疗基因导入患者体内。这种方式的导入，无疑有利于大规模工业化生产。但是，对这种方式导入的治疗基因及其载体必须证明安全性，而且导入体内后必须能够进入靶细胞，有效地表达并达到治疗目的。因此，在技术上要求很高，其难度明显高于体外途径。目前，对其研究日益增多，可能将成为基因治疗最有前途的方法。

基因治疗步骤：⑴选择治疗基因；主要是依据病因和发病学选定，对于某一种疾病治疗基因可以有多种，可通过优化组合来确定，这将有赖于人类基因组计划，尤其是功能基因组学的发展。⑵选择治疗基因导入系统（包括基因转移载体和基因导入途径）；是基因治疗的核心技术，是基因治疗是否能够进入临床和获得疗效的关键，因而始终是基因治疗的重点和难点。⑶治疗基因的表达。治疗基因、基因传递系统和基因表达系统是构成基因治疗药物的三个组成部分。

3基因治疗的原则

将治疗性基因以一定的方式高效导入所需部位，并使之在靶细胞中适时适量表达，从而达到治疗疾病的目的，这是最理想的基因治疗模式。其中有几个关键问题：首先是必须分离出含有调节序列的特异性基因；其次是必须能够获得足够数量携带该基因的载体或/和细胞；第三

必须建立一条有效的途径将该外源基因导入体内、转染靶细胞；最后转染入宿主细胞的目的的基因必须能产生足够量的产物，可维持适当长的时间，且不产生有害的副作用。简言之，导入体内基因要特异、稳定、高效、安全并具有可调控性。

3.1目的基因的选择

用于基因治疗的目的基因选择原则为:(1)该基因的异常是疾病发生的根源；(2)该基因遗传的分子机制清楚；(3)基因已被克隆，一级结构和表达调控机制较为清楚；(4)可在体外操作，而且安全有效；(5)转移基因在受体细胞内最好能够完整地、稳定地整合并能适时适量表达功能性蛋白质。基因治疗中选择的目的基因可以来自染色体基因组。也可以来自互补DNA ( complementary DNA,cDNA)。目前基因治疗研究中所应用的目的基因多数是通过cDNA克隆技术得到的。以恶性肿瘤为例，在基因治疗方案中，所用的基因大致可归为三类：一是细胞因子类；二是杀伤性基因类，以疱疹病毒I型胸苷嘧啶激酶(HSV-tk)为代表；三是以

P53为代表的抑癌基因或癌基因的反义基因类。

3.2受体细胞的选择

基因治疗选择受体细胞的原则为：(1)最好选择组织特异性细胞，即外源基因仅在该系统组织中表达，而在其它组织中不表达或表达水平较低；(2)细胞要易于从体内取出，有增殖趋势，且生命周期较长，使有足够的时间进行体外基因操作；(3)离体的细胞要能接受外源基因的转染；

(4)细胞经过体外基因操作后能够存活下来，并能安全输送回体内。根据疾病的性质、基因治疗的策略，靶细胞可以选择外周血淋巴细胞、骨髓造血干细胞、成肌细胞、成纤维细胞、角质细胞、呼吸道上皮细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞和神经胶质细胞等。

3.3基因表达载体的选择

目的基因本身一般不含有启动子等调控序列，导入靶细胞后很难得到目的基因的表达。因此，必须将目的基因重组于表达载体的合适位

置，再导入细胞，在特定调控序列指导下进行表达。表达载体有质粒载体(plasmid vector)和病毒载体(viral vector)两大类。质粒载体一般可用物理、化学以及融合法导入靶细胞。为了便于操作，构建的质粒载体不仅包含哺乳动物细胞的表达调控元件，而且也包含了细菌内进行复制的表达元件，因此被称为穿梭载体(shuttle vector )。目前被广泛应用于哺乳动物的质粒载体有pSV2, pRSV, pcDNA3和pCI载体系列等。这类载体的特点是可插入较大长度的外源基因(10kb以上)，有较为广泛的宿主细胞范围，经转染的细胞不发生裂解，故可建立稳定分泌外源蛋白的细胞株，用于ex vivo基因转移。上述载体随着采用的调控序列不同，其表达的效率也不同。病毒载体的构建与质粒载体相似，但进入靶细胞的方式不同。目的基因与病毒载体重组形成重组载体。在基因治疗中多是将此重组载体以不同方式进行包装，获得重组的病毒颗粒，再感染靶细胞，以便将目的基因带入靶细胞，并得到目的基因的表达。

4基因治疗中有待解决的关键问题

基因治疗是一种富有前景的治疗疾病的方法。然而，人类疾病基因治疗的限制主要是转基因方法的潜在风险，相对低效率和靶基因的细胞内稳定性。因此，基因治疗作为一种崭新的治疗手段要想应用于临床，那么就必须解决几个关键的问题。

4.1基因转染系统的安全性

基因治疗从实验室走向临床面临的第一个问题就是缺乏完善的基因转移载体系统。众所周知，对临床基因治疗而言，安全性尤为重要。1999年患者Jesse Gelsinger 的死亡，为基因治疗抹上了一层阴影。德国的华人科学家及其同事在用反转录病毒基因标记的动物模型中率先观察到白血病诱导作用，2002年法国基因治疗小组在为一名X染色体连锁的严重联合免疫缺陷性疾病(X-SCID )患者进行临床基因治疗试验后，又

发现了白血病样副作用。免疫学毒性也是病毒载体的又一个缺点，另外要注意的是在宿主内的融合转移基因和病毒的长期性影响。例如在一位接受基因治疗临床试验的患者的精子中发现了用于转基因的病毒，这就暗示了基因治疗可能改变患者后代基因的危险。美国国立卫生研究院重组DNA咨询委员会认为，用逆转录病毒为载体插入靶基因至患者细胞内进行基因治疗，可导致白血病发生，其原因是激发了失控的细胞生长，从而致癌。

4.2目的基因的有效性

目前尝试用于基因治疗试验的目的基因很多，但真正应用于临床的却寥寥无几，其主要原因之二是转基因至体细胞内适当位点的“低效性”。一方面，对于有效的基因治疗的体内应用，反转录病毒滴度仍然太低；另一方面，如果治疗性DNA未能整合入人体染色体，它在细胞内被终止或分解之前只有短时间内产生蛋白质，若想满足长期治疗需要，基因必须被嵌入依然未确定整合的染色体，并随细胞传代。“低效性"的其他原因是大部分的基因治疗是非特异的，对少数特异的基因治疗，在选择靶基因修复或敲除之前，需要确定哪一个是缺陷或突变基因；另外，大多数人类疾病是多基因致病(如癌症)，因此大部分单个基因转移的基因治疗往往得不到非常满意的效果。随着功能基因组学研究的开展，各种致病基因的发现及各种基因功能的进一步明确，将带动基因治疗的迅速发展。开发结合二个或更多基因的嵌合靶基因和嵌合载体的基因治疗是富有前景的。

4.3基因表达的稳定性

基因的相对稳定性是保持个体健康的关键，进行基因治疗时，不仅应当保持导入靶细胞或组织的基因自身的稳定性，而且靶基因转入后应能够持续、稳定地表达，从而产生良好的效果。目的基因表达的组织、时序及水平上的严格调控是这类基因治疗进入临床前必需解决的问题。为此，可以采用组织特异性启动子，设计能整合入基因组终末位点的载体，以避免整合至有潜在风险的位点，并使靶基因在特异的靶组织中长

期、稳定地表达，从而满足某些疾病(如血友病)的需要。然而，对于I型糖尿病，持续、稳定的基因表达只是取得最终目标的第一步，因为较高或较低的血糖水平对任何患者都是致命的。对糖尿病的一种确切的治疗是在每日变化的食物摄入中保持正常的血糖浓度。因此，稳定的转基因技术以及如何在期望的时间(定时)和适当的水平(定量)转导基因表达系统至靶器官，且靶基因持续、稳定地表达等问题，是基因治疗成功所必须的条件。研究疾病状态下基因表达调控的机制，开发及应用能被病理信号诱导的启动子元件表达载体系统具有临床应用价值。利用体内特定的生理信号实施转染基因生理水平表达的控制可能成为较理想的方法。

4.4目的基因转染的靶向性问题

早期基因治疗的疾病主要选择如肺囊性纤维化、ADA-SCID等遗传缺陷性疾病，治疗基因导入体内后即使不进行精确的调控也可获得较好疗效。而在用基因治疗其它多种疾病时，对目的产物的需要量要求严格，如果目的基因表达由载体或病毒启动子自发激活，表达不受控制，目的产物表达过度或不适当，不仅对疾病治疗不利，甚至可能引起致命的副作用。对于理想的肿瘤基因治疗，其目的基因的表达应能区别正常组织与恶性组织，但同时对恶性组织的类型无特殊选择性，能在多种癌症和肿瘤组织中表达，即实现所谓肿瘤特异性表达。目前应用于肿瘤试验性基因治疗载体的启动子可高效启动下游基因的表达，但基因表达缺乏选择性。

5 基因载体

尽管人们对做为疾病治疗手段的基因治疗充满巨大的希望，但开发高效临床方案的进展仍然缓慢。问题的关键在于安全和有效的基因导入系统(Gene delivery system)的开发。目前有许多载体系统，但没有一个载体可以达到安全、高效、靶向地把基因导入体内的靶细胞。不少临床

治疗方案失败于不合适的载体。为了使基因治疗能真正替代当前的常规方法，就必须研发安全、高效的基因导入载体。

理想的基因导入载体必须具有一些优异性能以便在体内能克服可能遇到的传输障碍，这些可能遇到传输障碍可分为三类：细胞外、细胞内和开发过程中产生的障碍。细胞外传输障碍包括生理盐条件的影响、血清的影响、细胞相关蛋白的影响和免疫系统的影响。所以一个理想的基因传递系统应该具有如下的特征：(1)良好的生物相容性(无细胞毒性和免疫原性，可生物降解)；(2)一定的包装容量，它应能转染长达1000kb 的DNA，能与DNA复合形成颗粒；(3)能保护DNA在血液转移过程中不被核酶降解；(4)能够将DNA输送至特定种类的细胞，包括处于静止期的细胞；(5)在细胞水平上，能将DNA送至所需的细胞器；(6)一旦达到合适位置，能释放DNA进行核转位或调节基因表达；(7)能够引起功能蛋白在特定细胞类型的持续表达而且它绝不会导致癌变；(8)制备方便。

现有的载体都只能部分满足上述条件，而不能提供所需的全部功能。目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。事实上，自1995年以来，全世界基因治疗领域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。当前主要使用的三种DNA转染系统是，物理转染系统(基因枪、电穿孔和裸DNA直接注射)，病毒载体和非病毒人工合成的转染载体。其中物理转染系统只能应用于皮肤、肌肉和肝脏等有限几种组织。因此基因治疗应用的载体主要集中于病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，已被广泛而有效地得到了应用。但是病毒载体存在许多不足，主要体现在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小等。非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到20%；但非病毒载体的生物安全性较好，特别是靶向性的脂质体、靶向性的多聚物，以及脂质体/多聚物/DNA复合物等新产品的出现，结合电脉冲、超声等新技术，明显提高了导入效率和靶向性，是今后非病毒载体发展的重要方向。

5.1 病毒载体

5.1.1逆转录病毒（retrovirous）载体

逆转录病毒是病毒性载体中应用最早、研究相当成熟、目前仍被广泛应用的载体。逆转录病毒较突出的优势是它可以有效地整合人靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座子的方式整合，其基因组不发生重排，外源基因不会受影响。近几年来，人们在增强逆转录病毒的靶向性方面作了许多尝试，并取得了一定成果。逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白（envolop env）决定，env来自何种病毒，包装出的逆转录病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。通过改变G蛋白可以改善载体细胞靶向性。如用水泡性口炎病毒的-蛋白包装逆转录病毒基因组产生假病毒，可以拓展逆转录病毒的靶细胞范围并赋予病毒颗粒新的特性。为提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，还可以在原来的病毒env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体（bcFv）。如Martin等设计的特异靶向黑色素瘤细胞的逆转录病毒，在病毒包被糖蛋白的表面结构域上连接特异识别高分子黑色素瘤相关抗原（HMW-MAA）的bcFv，90%的人黑色素瘤细胞高水平表达HMW-MAA这一穿膜分子，而绝大多数成人组织不表达。改造过的载体在bcFv的导向下与肿瘤细胞结合，大大提高了载体靶向的特异性。

慢病毒（lentivirus）也属于逆转录病毒家族，是一类很有前途的基因转移载体。它既可以感染分裂细胞又可感染非分裂细胞。该病毒载体能整合入靶细胞基因组、不需要反复转导细胞。最为人们熟知的慢病毒是人免疫缺陷病毒（HIV），复制缺陷型HIV可被用于基因转移。HIV 具有简单逆转录病毒的3个基因（gag、pol和env），此外还有6种辅助蛋白基因。以HIV-1为例，其进入细胞需要结合两种细胞表面受体，其中之一为固定成分，另一种为可变成分－趋化因子受体。这种趋化因子受

体可能是CCKR4（主要是T细胞表达）或CCDR5（主要是巨噬细胞表达）。利用HIV-1的这一特性可使基因转移具有特殊的靶向。虽然使用缺陷型病毒时靶细胞不表达病毒蛋白，但人们对其安全性还存有一定疑虑。目前，科学家们正尝试在不影响病毒功能的前提下尽量删除病毒序列以建立更加安全的慢病毒载体。

5.1.2腺病毒（Adenovirus，AV）载体

腺病毒也是转基因治疗中较常用的一种有效运载工具。它的宿主范围广，分裂和非分裂细胞均能感染。与逆转录病毒家族载体不同，腺病毒基因组不能整合到宿主细胞基因组中，而是以附加体的形式存在，不随宿主细胞分裂而复制，是典型的一过性表达载体，治疗中有时需要反复转导。这一特性对于免疫基因治疗来说是非常有利的，用腺病毒载体将不会导致象能整合的载体那样，使用后出现对免疫系统缠绵持久的刺激。

腺病毒转录单位密集而复杂，重组困难，仅限于特定的区域，一般是在E1、E2A、E3和E4。第一代腺病毒载体通常以转移基因取代E1A和E1B，但是这种载体有明显的缺陷：包装能力较低，细胞毒性较强，易引发免疫反应。近年来，在增大载体容量、降低细胞毒性、减弱宿主免疫反应等方面的研究有了很大进展，切除了E1和E3的第二代载体，延长了转移基因在体内的表达时间并降低了细胞毒效应。

虽然重组腺病毒载体应用日益广泛，但有几个主要缺陷仍需改进：腺病毒载体介导的基因表达通常都是短期的；在体内引发强的免疫和炎症反应；单次大剂量应用，会激发抗病毒的中和抗体产生，降低系统应用的效率；特异性较低。在这些领域，国外进行了大量研究。有人切除了腺病毒的E1、E2和E4基因后，发现能避免其在宿主细胞中表达免疫原性病毒蛋白。Belousova等报道，通过在衣壳上嵌合CD40配体，可以使腺病毒载体高效感染CD40阳性的树突状细胞和肿瘤细胞，这一特点可用于遗传性免疫疾病和肿瘤的基因治疗。Kreppel等构建的高容量腺病毒载体（HC-Ad）可以在大鼠视网膜色素上皮细胞中持续表达6个

月，而有人利用神经元特异的强启动子，使重组腺病毒载体在脑海马回中的表达时间可长达9个月。总之，腺病毒由于其本身的生物学特点，有其独特的优势，加强对腺病毒载体的基础研究，一定会促进这一基因转移载体的发展和完善。

5.1.3腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载体

AAV是一种缺陷病毒，不能进行独立复制，只有在辅助病毒如腺病毒、单纯疮疹病毒、痘苗病毒存在的情况下，才能进行最佳复制，产生新的病毒颗粒，否则只能进行潜伏感染。AAV载体具有安全，宿主范围广，可以长期表达转基因产物的特点，使它在基因治疗领域得到广泛的应用。现发现AAV有六种血清型，其中AAV-2研究得最为清楚，其基因组是长4680 bp的单链线状DNA，两侧为两个长145bp的回文序列，称反向末端重复序列（ITR），呈T形发夹样结构。ITR为病毒DNA复制，包装，“拯救”所必需的唯一顺式作用元件。AAV作为基因治疗载体的优势主要有：⑴AAV是一种人源性的病毒，对人体无致病性，免疫反应轻微；⑵可定点整合至人的19号染色体，并能较稳定的存在，从而避免了其它病毒随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险；

⑶AAV介导的基因转移系统可使外源基因持续稳定表达，并可受到周围基因的调控；⑷AAV的宿主范围很广，包括分裂期和非分裂期的多种细胞；⑸AAV转移系统具有较好21的热稳定性和抗酸碱性以及抗有机溶剂处理的特点，便于储存。但由于存在利用效率低的问题，目前科研工作者进行了大量关于增强AAV基因载体效应的研究，取得了可喜的成果。如Gao等用含有AAV的rep/cap基因盒的质粒感染A549细胞获得K209细胞，代替293细胞，使细胞内rep/cap基因的表达扩增1000倍，增加了r-AAV的产量。对不同的细胞，AAV载体的转染效率存在差异。Halbert 等报道，AAV-6载体对肺气道上皮细胞的转染率显著大于AAV-2载体，最高可达80%。用rAAV进行基因治疗若有轻度免疫反应，将影响转染效率。人群中约有50%－60%的人血清中带有抗AAV-2的抗体，其中有18%－7.5%为中性抗体，这些抗体的存在给rAAV的成功转导增加一定

的难度。Bartlett等对AAV表面进行化学修饰后，成功地转染了非病毒许可的人巨核细胞系。经过多年的研究，AAV载体在多种组织都进行了成功的转染，如肝、脑、心肌、骨骼肌、视网膜和气道上皮等组织，未发现对机体有致病性。

5.1.4单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）载体

单纯疱疹病毒Ⅰ和Ⅱ的基因组都是大型线性DNA，约150 kb长，包含70～80个基因。野生型病毒既可以感染细胞并裂解之，也可以在某些细胞类型如神经元中进入潜伏期。除对神经细胞有亲和性之外，单纯疱疹病毒还能感染多种细胞，包括肌肉、肿瘤、肺、肝和胰岛细胞，病毒滴度很高，可达108～109 PFU/ml。它不整合到宿主染色体上，但可在神经细胞核内持续存在。早期（immediate early，IE）基因ICP4基因突变后病毒就丧失了自主复制能力，只能在辅助细胞的帮助下进行增殖，这就是最初的单纯疱疹病毒载体。单纯疱疹病毒载体的一大优点是载体容量很大，为各种病毒载体之最，可容纳高达50 kb的外源DNA，因此可以同时装载多个目的基因。虽然单纯疱疹病毒载体的ICP4基因突变了，但是，其它IE基因仍然能够表达，而表达产物对许多类型的宿主细胞都有毒性，且在活体试验中引起严重的免疫反应，从而限制了这种载体在基因治疗中的应用。最近，有人构建了缺失ICP4、22和27的新型载体，可以降低对细胞的毒性水平，并延长基因的离体和活体表达时间。这种载体如果能够去除所有IE基因，同时建立起相应的辅助细胞系，那么将很有可能广泛应用于临床。另一种方法是，将原来载体结构上的所有单纯疱疹病毒结构基因全部去除，只保留了复制起点和包装信号顺序，再装上目的基因，然后与带有单纯疱疹病毒基因组但缺失了包装顺序的粘粒（cosmid）共转染宿主细胞。得到的病毒由于不带有任何病毒基因，因此也就不会产生由于单纯疱疹病毒蛋白低水平表达所带来的毒性反应。这种载体的致命缺点是病毒滴度太低，只有106～107

PFU/ml，约为改造前的1%。与其它病毒载体不同的是，在重组单纯疱疹病毒载体上使用外源启动子效果很差。绝大多数非单纯疱疹病毒来源

的启动子插入载体后，所控制的目的基因表达时间都很短，只有一周左右。通过对病毒生活史中的潜伏期的研究，人们正在努力构建一个经过修饰的潜伏期相关转录启动子（latency-associated transcript promoter，LAP），以保证外源基因能够得到长期稳定表达。未经修饰的LAP控制基因转录也是暂时的，但在引入一些可诱导元件后，可以使外源基因获得长期的甚至是细胞专一性的稳定表达。

由于单纯疱疹病毒具有天然的向神经性，这种载体在基因治疗神经系统疾病方面得到广泛的应用。以治疗帕金森氏病（PD）为例，这种载体要想在基因治疗PD临床试验中得到广泛应用，还要作出两方面的改进。第一，载体要能够兼容一系列有神经细胞和胶质细胞特异性的启动子，从而能够控制目的基因进行精确的细胞特异性表达。要做到这一点，可能需要引入染色质活化DNA元件，如LCRs或MARs。第二，要去除载体的细胞毒性。关于这一点，前面已有介绍，这里不再重复。

5.1.5其它病毒载体

除了以上病毒载体外，流感病毒、副流感病毒、痘病毒、新城疫病毒等也在不程度上得到研究和应用。

综上所述，病毒是非常有效的转基因载体，然而，病毒载体的使用受限。缺陷在于，病毒载体的结构会产生免疫反应或细胞毒性。虽然复制缺损型结构被大量用于疾病的治疗，但是危险性在于产生致病的缺损型病毒。逆转录病毒仅被用于有丝分裂系统，而这种病毒又会引起基因组的致癌反应。重复使用病毒载体会诱导免疫反应，从而削弱转基因的表达效果。非病毒载体可以克服病毒载体的缺陷，具有低细胞毒性和低免疫反应等。此外，非病毒载体没有基因尺寸方面的限制，而病毒载体被限制在6-8 kbase。考虑到病毒载体的这些局限性，对非病毒载体的研究愈来愈引起人们的关注。

5.2非病毒载体

由于在不同的试验与治疗方面，非病毒载体系统表现出多种潜在的优越性，越来越多的实验室选择非病毒载体基因转移系统作为研究方向。将非病毒载体大体分为两种，物理方法途径和化学方法途径。

5.2.1裸DNA介导的基因转移

裸DNA是最简单的一种基因治疗形式。它是由编码生物活性物质的基因及作为其载体的质粒组成。1990年，Wolff JA等人发现，当将纯化的质粒DNA直接注射到小鼠骨骼肌细胞中后，该基因能够表达，并且在接种两个月后，编码的酶仍然具有生物学活性。这是人们首次发现DNA 免疫现象。自此，许多人致力于开发将可编码蛋白抗原的质粒直接导入动物组织，诱导动物的免疫系统对所表达的蛋白质产生体液免疫或细胞免疫，这也就是我们常说的基因疫苗。除了导入编码蛋白质抗原的基因外，也可以导入编码其他具有药理活性的基因分子，如表达促红细胞生成素（EPO），以用于恶性肿瘤的治疗。裸DNA在体外不能转染细胞，但在体内原位注射时（尤其是肌肉和皮肤），它能有较高的转染效率。但至今人们对裸DNA到底是如何转染细胞，在体内发挥机制的具体过程仍不清楚。但人们发现，当向小鼠门静脉或尾静脉以较大体积注射入质粒时，能引起较高效率表达，这为我们利用裸鼠研究基因功能提供了一种简单手段。裸DNA作为基因载体的优点是可利用细菌比较廉价地大量生产带有药物基因的质粒。但其稳定性和转染效率均不高，也很难有靶向性。

5.2.2基因枪与电穿孔

基因枪是指将质粒DNA包被在金微粒子表面，利用高压氦粒子流装置的仪器将DNA加速，有效地将DNA带入靶组织。这种装置可将DNA 直接打入细胞核内，可避免药物DNA被酶降解。Degano等人研究表明，几十纳克的DNA即可获得较强烈的免疫应答。其缺点是操作较复杂，对设备有特殊要求。且基因枪仅使金属颗粒深入组织中几毫米，限制其应用。电穿孔法是指在电流刺激下，细胞膜瞬时出现孔洞，从而使DNA进入细胞。应用电穿孔进行体外DNA的转染研究已经有许多年

了，最初只是将其用作一种试验手段，用于真核细胞或细菌的转化试验，后来被用于基因治疗，试验证实这种方法可提高DNA对小鼠皮肤细胞及肿瘤细胞的转染效率。

5.2.3阳离子脂质体介导的基因转移

阳离子脂质体作为基因治疗的载体是目前研究的热点之一，其转染率比pH敏感脂质体高了150倍。自1987年，Felgner等人首次报道了阳离子脂质体可介导基因的体外转染。其后，人们做了大量工作来研究阳离子脂质体作为基因载体。阳离子脂质体本身带有正电荷，可以与带有负电荷的质粒DNA通过静电作用紧密结合，形成脂质体与DNA的复合物，其可保护DNA不受DNA酶降解。研究表明，阳离子脂质体可以包裹任意大小的DNA，现已成为将外源基因导入真核细胞的常规载体。脂质体已经有商品化产品，其中以Lipofection公司的产品最为著名。脂质体与DNA的复合物进入细胞及在胞内发挥作用的机制也是近年来研究的热点。研究发现，细胞表面的蛋白聚糖（PGs）对复合物进入细胞起重要作用，因为合成PGs缺陷的细胞难于转染。另外，在脂质体与DNA的复合物上加入配基或加入有助于融合的脂，如二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE），也可提高其转染效率。阳离子脂质体易于大量制备，不自我复制，且对它的不断改进提高了其转化的效率，已经通过美国国立卫生研究院（NIH）和重组DNA咨询委员会（RAC）的批准作为基因治疗的载体进入Ⅱ期临床试验，用于某些癌症的治疗，但其缺点是表达时间短和靶向性低。

5.2.4 DNA包装颗粒介导的基因转移

用合成或天然的物质来与DNA结合，以模仿病毒组分，有效的压缩DNA长链分子，以提高其转染效率，这就是DNA包装颗粒所介导的基因治疗。DNA包装颗粒的主要形式是多聚阳离子，例如多聚赖氨酸、多聚精氨酸，组蛋白、脱乙酰壳多糖、聚乙烯亚胺（PEI）等。由于DNA 带负电荷，多聚阳离子带正电荷，它们可通过电荷作用紧密结合，使DNA由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子。Legendre等人报道N-

端取代的不同长度和序列的寡聚甘氨酸可压缩质粒DNA至50－100nm的粒子。与阳离子脂质体介导的系统相比可提高其转染效率。在众多的DNA包装颗粒中，PEI受到了人们的广泛关注。已经通过不同的给药途径如肺滴注、肾融合、颅内注射、静注等用PEI进行体内基因转移的试验。对PEI的研究还发现，不同分子量或不同异构体的PEI在体内转染效率及毒性均不同，这个发现揭示人们可通过研究物质结构与功能的关系，从而寻找新型载体系统。天然多聚物明胶和壳多糖早已被用于做载药微球体。近期有研究表明，它们可与DNA形成纳米粒子，这为DNA 纳米粒子作成口服疫苗提供了可能。DNA包装颗粒的优点是易于大量生产、加入目标配基后可实现靶向转移、较低的免疫原性等。其缺点是体内转染效率不高和基因的表达时间短。

5.2.5 纳米控释系统

纳米控释系统包括纳米粒子和纳米胶囊，它们是直径在10～500 nm 之间的固体胶态粒子，活性组分（药物、生物活性材料等）通过溶解，包裹作用位于粒子内部，或者通过吸附、附着作用位于粒子表面。制备纳米控制系统的载体材料都是高分子化合物，以合成的可生物降解的聚合物体系和天然的大分子体系为主，前者如聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乳酸—聚乙醇酸共聚物等，它们在体内通过碳链的水解作用而降解，降解产物对人基本无毒性；后者如天然的蛋白、明胶、多糖等。用纳米控释系统输送核苷酸有许多优越性，如能保护核苷酸，防止降解。Chavany 等已经证明无论在缓冲液还是细胞培养基中，结合在纳米粒子上的寡核苷酸都具有对抗核酸酶的作用，防止了核苷酸的降解，并且通过细胞对纳米粒子的吞噬作用而增加了寡核苷酸进入细胞内的量，同时增加其在细胞内的稳定性。并且，Nakada等也证明了纳米控释系统在体内同样能保护寡核苷酸，防止降解。他们将33PpdT16特异地输送到肝脏，同时减少在肾和骨髓中的分布，静脉注射5 min，纳米粒子能部分地保护pdT16，防止其在血浆和肝脏中降解，而游离的pdT16在此时已完全降解。纳米控释系统也有助于核苷酸转染细胞并可起到定位作用，能够靶

向输送核苷酸。Godard等将胆固醇结合到十二聚体的寡脱氧核糖核酸上，形成复合物，该复合物通过胆固醇基团吸附到聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒子上，然后转染人膀胱癌细胞T24，该复合物能与Ha-ras原癌基因mRNA变异区互补而形成双螺旋，从而起到反义效果，抑制了人膀胱癌细胞T24在培养基中的增生。所以纳米控释系统有望成为基因治疗和反义治疗方案中的重要组成部分。反义基因治疗指利用设计好的

RNA/DNA寡核苷酸片段特异性地结合有缺陷的DNA序列，通过体内的错配修补，使有缺陷的靶DNA片段改变为正常的基因序列，从而调节基因的表达。这种技术主要用于单碱基突变的基因病。有报道表明此方法可在血细胞中达到10%改正率，在大鼠肝细胞达到40%改正率。

RNA/DNA寡核苷酸链相对较小，其所用的基因载体很广泛，可以与阳离子脂质体、阳离子多聚物和中性、阴性的脂质体形成复合物。反义药物易被内源性核酸酶降解，因而稳定性不高，这是影响其应用的重要缺陷。

非病毒基因治疗已经发展十几年了，取得了一定的成就，但仍然存在一些问题：(1)载体如何携带DNA进入细胞内？DNA是如何进入细胞核内并发挥作用的具体过程？如何表达药物蛋白，以及基因又是如何被关闭等，人们仍不十分清楚。(2)非病毒转移系统面临着表达时间短、表达效率低的难题。基因转移系统表达效率的高低取决于基因从给药部位到达目标细胞的细胞核内的这一过程所遇到的各种障碍。这些障碍包括有免疫系统、血液循环系统、枯氏细胞及内质网细胞之间的孔状结构的限制性大小、核膜等。其中核膜是一个重要的障碍，一般情况下，进入细胞质的基因也只有一小部分能最终进入核内。血清效应也是非病毒基因载体所面临的一个重大难题。例如，当脂质体与DNA的复合物注射到瘤内时，其物理性质到达靶细胞时改变不大。相反，当静脉注射脂质体与DNA的复合物时，到达靶细胞时，其大小、结构及电荷都有极大的改变。(3)尽管安全性是非病毒基因治疗的一大优点，但长期应用的安全性还有待于进一步考察。所以，为构建理想的载体系统，仍需科学工作者

的大量的基础研究。

人们仍需根据具体的疾病种类，给药途径等，选择治疗该疾病适宜的载体系统及治疗方法。在基因治疗发展的初期，曾遇到许多困难，有些人对其持有怀疑态度，但事实证明，基因治疗正一步步向着好的方向发展。从长远上来说，非病毒基因治疗的方法由于载体具有高安全性、低免疫原性和容易大规模生产等优点，越来越受到人们的重视。非病毒载体系统的研究，必定会使基因药物的研究向前迈进一大步。

6 阳离子聚合物基因载体

目前基因载体总体设计上主要分为病毒载体与非病毒载体，这两类载体各存在自身的优势与缺点。前者所用病毒载体主要为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及单纯疤疹病毒，其优点是转染率高，缺点是缺乏安全性，可能诱发癌症与不希望的自身免疫反应及白细胞的病毒变化，并存在非靶向性、有限的携带能力、生产和包装等方面的问题，目前科学界已将研究中心逐渐转向非病毒载体。

虽然非病毒载体目前在体内转染效率及基因表达水平方面低于病毒载体，但因其具有低毒、低免疫原性、能够携带大量DNA分子、容易大批量生产及费用低廉等优点而备受关注。至今，最有希望的非病毒载体是阳离子脂质体和阳离子聚合物。

6.1 阳离子聚合物主要类型

阳离子聚合物，又称聚阳离子，可通过结构修饰来改变它的理化性质来提高转染效率、增加稳定性和靶向释放。阳离子聚合物可通过静电吸附，与DNA吸附并将其压缩而形成纳米尺寸的聚合电解质复合物(Polyelectrolyte complex，PEC)所形成的复合物能通过细胞内吞作用进

入细胞，并可保护基因不受抗核酸酶I的攻击。以阳离子聚合物为载体的基因传递系统，在输送到靶细胞前及进入细胞后必须跨越一系列生理屏障才能将DNA送入细胞核内进行基因表达。阳离子集合物首先与DNA通过静电吸附形成复合物，通过血液循环可达组织靶细胞。第一个屏障就是需要穿越细胞膜。复合物必须形成纳米尺寸的粒子才能被细胞内吞摄入，并形成内含体。细胞体内的溶酶体酶对DNA的攻击成为基因转染的又一屏障，载体必须保护DNA不受溶酶体酶的作用，才能保证较高的转染效率，这是基因转染效率高低的关键一步。最后，基因在逃脱溶酶体酶后，载体将基因顺利送入核内，同样也影响基因的表达和功能。

目前主要研究的阳离子聚合物包括：聚-L-赖氨酸及其衍生物、聚乙烯亚胺(PEI)及其衍生物、阳离子树状聚合物、聚凝胺(Polybrene)、凝胶、四氨富勒烯(tetraminofullerene)及阳离子多聚糖等。虽然阳离子聚合物基因载体相对病毒载体有其优势，但其转染效率低、可降解能力弱及细胞兼容性差等仍是限制这类载体发展并需待解决的问题。基因传递的阳离子聚合物主要是多聚胺(Polyamines)，这类高分子聚合物含有伯、仲、叔及季胺基团并能在生理环境下荷正电，故能与带负电的DNA吸附。

6.1.1 聚-L-赖氨酸(PLL)及其衍生

自从首次观察到PLL与DNA形成聚合电解质复合物PLL作为基因载体得到了广泛的应用。PLL结构中的伯胺基数量是复合物形成的重要因素。虽高分子量的PLL在一定程度上利于基因转染，但与DNA所形成的复合物不仅毒性较高，而且容易引起复合物自身的聚集和沉淀(取决于溶液离子强度的大小)。复合物的表面正电荷能与细胞膜上的负电发生非特异性吸附而进入细胞，但复合物表面电荷会引起一定细胞毒性，并非特异性吸附血清蛋白而导致在血循环中被迅速清除。通过聚乙二醇(PEG)化的PLL-PEG共聚物基因载体，能避免复合物之间的聚集及被体内血清蛋白吸附，并可降低细胞毒性。

6.1.2 聚乙烯亚胺(PEI)及其衍生物

PEI因对不同类型细胞均有较高的转染效率且转染重复性好，成为近十几年来研究及应用最广泛的聚阳离子基因载体之一。PEI结构中伯、仲、叔胺的比例分别为1:2:1，其中三分之二的氨基能在生理条件下质子化。PEI强大缓冲容量则源于其不同pKa值的未质子化氨基，此缓冲特性可协助PEI逃逸内含体及溶酶体酶的攻击(质子海绵效应)，使DNA 在内含体中不被降解，有利于DNA在胞内的转运。高电荷密度是PEI引起显著细胞毒性的原因。支链化PEI与线性PEI相比具有更高的转染效率及更低的毒性。为解决PEI的毒性，Petersen等尝试用合成不同PEG接枝率的PEI-g-PEG接枝共聚物。接枝后的PEI细胞毒性显著降低，而转染率与PEI相比几乎未变。细胞毒性受PEG的接枝率的影响，而与PEG分子量无关。细胞毒性受PEG的接枝率的影响，而与PEG分子量无关。

6.1.3 可降解阳离子聚合物

大多数阳离子基因载体的骨架包含了不能在生理环境下降解的碳碳单键及酞胺键。这些不可生物降解的基因载体难以被体内清除系统所识别，因而容易聚集在细胞和组织内引起更高的毒性。为解决该问题，研究合成了一系列可降解基因载体。总的来说，生物可降解材料比未修饰的PLL或PEI的毒性要低得多，而转染效率相差不大或更高。Kim研究小组合成了一种可降解的PLL衍生物聚:聚(a-（4-氨基丁基）-L-聚乙醇酸) (PAGA)。PAGA能高度压缩质粒DNA形成平均粒径为约6nm的纳米粒，复合物在37℃水溶液中24小时内能完全解离PAGA比PLL的转染效率高得多而在试验范围内未能检测到其毒性。

通过交联低分子量PEI(0.8kD)至聚乙二醇-bis-唬拍酸丁二酞亚胺酷或含二硫化物的交联剂，能合成可降解PEI。这些交联化的PEI比高分子量的PEI毒性低得多，所形成的复合物转染效率比0.8kD的PEI要高。交联1.8kD PEI至戊二醛以引入酸不稳定亚胺键的聚合物，在pH4.5溶液中一半亚胺键能在一小时内断裂，这种酸不稳定PEI在生理pH下相对稳定，表明该PEI衍生物在酸性内含体条件下，可降解成为比高分子量PEI

毒性的更弱的低分子量PEI。酸不稳定型PEI转染效率与25kD PEI相等，而前者毒性却比后者低很多。

生物可降解聚(2-氨乙基丙烯酸)(PPE-EA)由磷酸酷骨架及氨乙氧基侧链构成。PPE-EA磷酸醋骨架能被水解成丙二醇、磷酸及氨基乙醇。这种聚合物在浓度为o.lmg/ml时比PEI及PLL细胞毒性都要低很多，所形成的复合物在核酸酶I作用下，质粒很长时间内不会被降解。在PBS介质中，质粒3小时候后即能从复合物中被释放，4-5天释放完全。PPE-EA 特别是在氯哇作用下，转染效率比PLL高很多。

6.2 阳离子聚合物的基因传递机制

阳离子聚合物在真核细胞中基因转染可分为几个步骤：DNA的复合，细胞接触，从内含体中释放，核运输，载体分解。质粒DNA与阳离子聚合物载体作用形成球状多聚复合物，这些多聚复合物与细胞膜作用并进行胞吞形成内涵体(吞噬体)，阳离子聚合物，例如PEI通过质子海绵效应使内涵体不稳定从而导致多聚复合物从内涵体中解脱出来。多聚复合物随后进入细胞核，然后DNA从多聚复合物载体中分离出来至核膜内或核膜外，被释放的DNA在细胞里进行转录和翻译并得到所需要蛋白产物。这些步骤都和阳离子包裹的基因传递密不可分，充分弄清这些步骤的机理对提高基因传递的效率是非常重要的。

1) DNA的复合

阳离子修饰的基因传递是基于阳离子聚合物和DNA磷酸基团负电荷相互电子作用。DNA复合保护了DNA免受核酸酶的降解，并且压缩的粒子容易被细胞通过胞吞的作用进入细胞。决定DNA复合物的大小的因素有DNA的浓度，溶剂的离子强度以及阳离子聚合物和DNA分子的大小等。阳离子聚合物同DNA复合成的粒子大小通常制约着基因转染效率，如：21kDPEI复合DNA的最小直径可以达到2um而25kD PEI复合的