高效液相色谱学习PPT培训课件

的溶剂进行洗净。
采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再 生。
30
HPLC检测器应提供的功能 对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并 且所设计的校正技术应该促进这种关系

31
理想的HPLC检测器 高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性
5
高效液相色谱仪组成

输液系统 进样系统 分离系统



检测系统
数据记录处理系统

6
液相色谱流程图
HPLC色谱柱 溶剂 自动进样器 色谱泵 检测器 废液
数据处理系统
7
8
液相色谱的流动相
9
液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
time
强溶剂 A%
5 2 1
19
梯度洗脱
3
2
1
20Байду номын сангаас
21
梯度：低压混合
低压梯度


用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高


不易调节梯度的滞后体积

如设计不当，梯度的
准确性受影响

滞后体积（系统 体积）设计合理
22
梯度滞后：系统体积的影响
低 压 梯 度
A B D C
溶剂输送 系统(泵)
•
理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um
的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
13
过滤与脱气

过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使 用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积


普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml
24
滞后体积变化的影响


设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间


例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min

实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题

对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min

实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受

滞后体积的不同会使方法转换麻烦

滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现
滞后体积的变化会导致梯度重现性不好
吸光度（Absorbance UV/Vis）检测 目前实验室中最流行的选择 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是 多波长，25%是PDA） 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
25
液相色谱的色谱柱
26
27
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
28
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
29
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的固
定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适
HPLC的 使用与维护
1

基本原理和特点 液相色谱仪器部件


实验操作与应用
日常维护

2
基本原理和特点

基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附,分 配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中滞留

2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形
3）检测器中的气泡产生基线波动
14
15
16
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
17
1．梯度洗脱的特点



32
灵敏度：信噪比 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值 （S/N） 6:1 检测限（LOD）：S/N = 2~4 定量限（LOQ）：S/N = 8~10 好的信噪比有利于： S 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性



N
33
（1）改善分离, 加快分析速度； （2 ）改善峰形 , 减少拖尾 , 有利于痕 量组分的检测； （3）增加峰容量；
（ 4 ）强烈滞留的组分不容易残留在
柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
18
2．梯度洗脱的主要条件 ① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成； ③ 梯度时间； ④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
阻尼器 混合器
色谱柱 进样器 检测器
比例阀
滞后(系统)体积 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 滞后(系统)体积 高 压 梯 度
溶剂输送 系统(泵) 溶剂输送 系统(泵)
梯度混合器
23
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
进样器
色谱柱
检测器
梯度滞后大小的影响
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟
时间不同,从而先后从固定相中流出.

特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动
化。
3
一些商品化仪器
检测器 柱温箱 流动相 脱气装置 样品盘
控温箱
四元泵
4
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源， 待设备通过自检后，打开计算机启动
色谱管理软件
准备流动相 过滤，脱气 色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵
pH变化值 0.1
RS变化值 1.6
10
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
11
对溶剂的要求 水： 去离子水 纯净水


自动纯水仪 商品瓶装水
溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）

试剂: 分析纯
12
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。