(新)基因的原核表达

原核表达中可能遇到的困难
• 稀有密码子:
Arg密码子AGA,AGG,CGG,CGA, Ile密码子AUA, Leu密码 子CUA, Gly密码子GGA 和Pro密码子CCC在E.coli中很 少使用，当异源目的基因的mRNA在E.coli中表达时， tRNA的数量直接反映了mRNA的密码子偏倚性。一个 或多个的稀有或缺少可能导致翻译的停止。成串或多 个稀有密码子时，外源蛋白的表达将非常低，且产生 不完全产物。 在宿主菌中增加稀有密码子tRNA，含有稀有密码子基因 的蛋白产量大大提高
• pGEX系列： pGEX-4T－1，2，3 • 具有T7 promoter ,lac operator， Amp+， N-端GST ，Thrombin or Factor Xa蛋白酶 切位点，能表达毒性蛋白, IPTG诱导
• 寄主菌： BL21(DE3) ,BL21(DE3)pLysS, BL21-CodonPlus(DE3)-RiLp contains extra copies of the tRNA genes that are rare in E.coli but more frequently in other organisms • TOP101
原核表达的步骤
• 挑单菌落接种5 含抗生素的LB 液体培养基中， 370C 过夜，约10－13小时 • 1：100—150倍转接新鲜的抗生素的LB 液体培 养基 • 约3小时，OD600 为0.4—1（建议OD600为0.6）, 加IPTG，一般0.025—1mM, 370C诱导4小时 • 离心收集菌体，SDS—PAGE 电泳 • 镍离子柱子或抗GST抗体亲和柱子纯化或 SDS—PAGE 电泳后割胶回收SDS—PAGE 电 泳
Leabharlann Baidu
基因的原核表达
• 原核表达质粒： • pET-3—45,具有T7 promoter, lac operator, His-Tag(6 xHis), kam+ , IPTG诱导 pET-28a,b,c (Novagen, Invitrogen) pBAD系列，具有araBAD promoter for tightly regulated expression in E.coli, HisTag(6 xHis), Amp+,L-ARABINOSE诱导
• 信号肽 • 毒性基因及质粒稳定性：羧苄青霉素代替氨苄青
霉素 • 目的mRNA 和蛋白不稳定：25-300C 诱导
• mRNA 转录产物的二级结构：载体均产生下列转录产 物之一 ： 5—AAGAAGGAGAUAUACAUAUG—3 5—AAGAAGGAGAUAUACCAUGG—3 目的基因中5—CATATGTATATCTCCTTCTT—3 OR 5— CCATGGTATATCTCCTTCTT--3 mRNA 转录产物的二级结构可干扰ATG翻译起始密码子 与核糖体结合