2第二章 培养基灭菌

第二章 培养基灭菌
第二章 培养基灭菌
第一节 概述 第二节 加热灭菌的基本原理 第三节 分批灭菌的设计计算 第四节 连续灭菌的设计计算
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本章学习要点
1、熟练掌握培养基灭菌的意义和原理、常用的灭菌方法 和相关计算设计。分批灭菌和连续灭菌的概念。理解培养 基灭菌的残留定律。 2、了解培养基灭菌在发酵工业中的选用及设备流程。培 养基灭菌的工程设计、培养基与设备、管道灭菌条件。理 解培养基连续灭菌和分批灭菌的特点及高温短时灭菌技术 原理；培养基连续灭菌和分批灭菌技术的优缺点比较及其 应用。 3、了解影响培养基灭菌的因素。
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主要原理
在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越 高，繁殖越快。但温度太高，细菌就会死亡。不同的细菌有 不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。
巴氏消毒其实就是利用病原体不是很耐热的特点，用适当的 温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍 保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此 巴氏消毒牛奶要在4℃左右的温度下保存，且只能保存3~10 天，最多16天。
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主要应用 主要为牛奶的一种灭菌法，既可杀死对健康有害的病原
菌又可使乳质尽量少发生变化。也就是根据对耐高温性极强 的结核菌热致死曲线和乳质中最易受热影响的奶油分离性热 破坏曲线的差异原理，在低温下长时间或高温下短时间进行 加热处理的一种方法。其中，在60℃以下加热30分钟的方式， 作为低温灭菌的标准，早为世界广泛采用。利用高温处理， 虽对乳质多少有些影响，但可增强灭菌效果，这种方法称为 高温灭菌（sterilization），也就是在95℃以上加热20分钟。 巴氏灭菌法除牛奶之外，也可应用于发酵产品。
方法是：将待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮15～60分钟，以 杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37℃下保温过 夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜， 如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。
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加压ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常规加压灭菌法
• 盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽空 气后将锅密闭，再继续加热至121℃（压力为1kg／cm2 或15磅／英寸2），时间维持15～20分钟，也可采用在 较低的温度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下 维持35分钟的方法。
紫外线、阴极射线、X射线、γ射线
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3.加热灭菌
高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要 生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、 脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。
每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物 处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状 态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶 体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内 死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。
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目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种：
一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。采用这一 方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达 97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌 以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无 害反而有益健康。
第二种方法将牛奶加热到75~90℃，保温15~16秒，其杀 菌时间更短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病 原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。
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2 必要性
为什么要进行培养基灭菌？
由于生物反应系统中通常含有比较丰实的营养物质，容易 受到杂菌污染，由于杂菌的存在，会有以下各种不良后 果：
•1)生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产 能力的下降。
•2)由于杂菌所产生的一些代谢产物改变了发酵液的某些理 化性质，使目标产物的提取困难，造成收得率降低或使 产品质量下降。
灭菌与消毒的区别 • 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包
括营养细胞、细菌芽孢和孢子 • 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源
微生物。
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防腐（antisepsis）
防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生 长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。 （1）低温 （2）缺氧 （3）干燥 （4）高渗 （5）高酸度 （6）防腐剂
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连
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（ 1 ）干热灭菌法 利用热空气将微生物体内的蛋白质氧化进行灭菌。 灭菌条件： 160℃下处理60min 将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内， 160～ 170℃ 维持1～2小时，即可达到彻底灭菌的目的。在这种 条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥， 以及各种细胞成分发生氧化。
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通常，市场上出售的袋装牛奶就是采用巴氏灭菌法生 产的。工厂采来鲜牛奶，先进行低温处理，然后用巴氏消 毒法进行灭菌。用这种方法生产的袋装牛奶通常可以保存 较长时间。
巴氏消毒法也不是万能的，经过巴氏消毒法处理的牛奶仍 然要储存在较低的温度下（一般＜4℃），否则还是有变 质的可能性。因此市场上很多出售袋装牛奶的方法是很不 规范的。
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一、灭菌的概念和必要性
微生物的培养过程： 培养基配制→灭菌→接种→培养
1. 灭菌的定义
用物理或化学因素除去物品上所有生活微生物的方法。 工程上的灭菌是指用物理或化学因子杀灭有生活能力的细菌
营养体和芽孢或孢子的方法。 消毒是消除病原微生物的措施。 在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。工业规模的液体培
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高温对培养基成分的有害影响及其防止
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消除高温有害影响的措施
（1）采用特殊加热灭菌法 （2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与
其他成分分别灭菌后再合并；
（3）对含Ca 2+或Fe 3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌， 然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；
（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合 培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8 磅／英寸2下灭菌15分钟）或间歇灭菌；
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现行方法
当今使用的巴氏杀菌程序种类繁多。
“低温长时间”(LTLT)处理是一个间歇过程，如今只被小型 乳品厂用来生产一些奶酪制品。 “高温短时间”(HTST)处理是一个“流动”过程，通常在板 式热交换器中进行，如今被广泛应用于饮用牛奶的生产。通 过该方式获得的产品不是无菌的，即仍含有微生物，且在储 存和处理的过程中需要冷藏。“快速巴氏杀菌”主要应用于 生产酸奶乳制品。
巴氏消毒纯鲜奶较好地保存了牛奶的营养与天然风味， 在所有牛奶品种中是最好的一种。其实，只要巴氏消毒奶 在4℃左右的温度下保存，细菌的繁殖就非常慢，牛奶的营 养和风味就可在几天内保持不变。
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（2）湿热灭菌法
利用高温饱和蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质 变性进行灭菌。 灭菌条件： 121℃下处理30min 多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10min后即可 杀死； 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才 能杀死； 而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。
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4 培养基灭菌的目的
• 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件 。
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二、灭菌的方法
1.化学试剂灭菌 2.电磁波、射线灭菌
紫外线、阴极射线、X射线、γ射线 3.加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法）
火焰灭菌、干热灭菌、湿热灭菌
工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。 湿热灭菌简便、有效、经济。
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连续加压灭菌法优点 ①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限
度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比 “实罐灭菌”（120℃，30分钟）提高产量5～10％； ②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了 发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率； ③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率； ④适宜于自动化操作； ⑤降低了操作人员的劳动强度。
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化疗（chemotherapy）
• 化疗即化学治疗。它是利用具有高度选择毒力（即对病 原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来 抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该 传染病的一种措施。
• 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化学 治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成 分等。
火焰灭菌（灼烧），利用火焰直接将微生物杀死。是一 种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种 针等少数对象的灭菌。
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巴氏灭菌法(pasteurization)，亦称低温消毒法，冷杀菌 法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品 中营养物质风味不变的消毒法。
巴氏灭菌法的产生来源于巴斯德解决啤酒变酸问题的努力。当 时，法国酿酒业面临着一个头疼的问题：啤酒在酿出后会变酸， 根本无法饮用。而且这种变酸现象还时常发生。巴斯德受人邀 请去研究这个问题。经过长时间的观察，他发现使啤酒变酸的 罪魁祸首是乳酸杆菌。营养丰富的啤酒简直就是乳酸杆菌生长 的天堂。采取简单的煮沸的方法是可以杀死乳酸杆菌的，但是， 这样一来啤酒也就被煮坏了。巴斯德尝试使用不同的温度来杀 死乳酸杆菌，而又不会破坏啤酒本身。最后，巴斯德的研究结 果是：以50~60摄氏度的温度加热啤酒半小时，就可以杀死啤 酒里的乳酸杆菌和芽孢，而不必煮沸。这一方法挽救了法国的 酿酒业。这种灭菌法也就被称为“巴氏灭菌法”。
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讲述的内容 第一 培养基灭菌的目的、要求和方法 第二 湿热灭菌的理论基础 第三 培养基灭菌的工程设计 教学要求：掌握培养基和设备灭菌的意义和方法。分批
灭菌和连续灭菌的优缺点比较。培养基灭菌的工程设 计、培养基与设备、管道灭菌条件。
重点：要求深刻理解与熟练掌握的重点内容
1、常用的各种灭菌方法及在发酵工业中的选用。
养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。 灭菌的目的：纯种发酵。
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消毒（disinfection）
• 从字义上来看，消毒就是消除毒害，这里的“毒害”就是 指传染源或致病菌的意思，英文中的“dis-infection”也是 “消除传染”的意思。
• 所以，消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体 表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的 物体基本无害的措施。
• 此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发 酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。
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连续加压灭菌法
• 在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵 工厂中作培养基灭菌用。
• 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热 、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135 ～140℃下处理5～15秒钟。
•3)污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失效。
•4)发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失效。
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3 工业上具体措施
包括： 1）使用的培养基和设备须经灭菌； 2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； 3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； 4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； 5）使用无污染的纯粹种子。
湿热灭菌要比干热灭菌更有效。
a.原生质在含水量高的情况下易变性凝固
b.蒸汽的穿透力强
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湿热灭菌效果：致死温度和致死时间 致死温度：杀灭微生物的极限温度。 致死时间：在致死温度下或以上灭死微生物所需时间。 热阻：微生物在某一特定条件下的死亡时间。
湿热灭菌分：a.分批灭菌
b.连续灭菌
间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培 养基的灭菌。
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1. 化学药物灭菌
利用化学试剂对微生物的氧化作用或损伤细胞等 进行灭菌。
常用的化学试剂： 氧化剂：0.%~0.25%KMnO4溶液、0.5%~1%漂白粉溶液 醇醛类：75%酒精、0.25%新洁尔灭、10%甲醛溶液、环氧
乙烷 酚类：苯酚溶液、来苏尔
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2.电磁波、射线灭菌
利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生的高能 粒子射线穿透微生物细胞进行灭菌。
2、培养基灭菌原理，分批灭菌和连续灭菌的概念。
难点：1、培养基灭菌方法的选用。
2、培养基灭菌的理论基础。
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第一节 概述
一、灭菌的概念和必要性 二、灭菌的方法 三、培养基灭菌的要求 四、液体培养基灭菌的特点
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本节知识点：
染菌的危害性 灭菌的方法 培养基灭菌的要求 液体培养基灭菌的特点
重点： 热灭菌原理