第6章 染色体显微操作1

改进的染色体微分析技术
染色体微分析技术就是在对染色体显微切割和
分离的基础上建立起来的。因此它的前提是必须对 染色体能够准确地识别和精确切割与分离。国内改 进了当前普遍应用的倒置显微镜切割的方法，采用 了普通透射光学显微镜，用100倍油浸物镜在1000-
1500高倍数下，对染色体进行切割和分离，不但对
第六章 染色体显微操作
染色体微分析技术包括：染色体显微切割、分
离；PCR体外扩增；微克隆技术，染色体或特异区扩 增产物间的 Southern 杂交及特异 DNA片段的 FISH定位。 该项技术是近十多年来随分子生物学技术发展而诞 生的一项生物高新技术，它既有细胞生物学的可视 性，又有分子生物学的先进性，在染色体结构、基 因组和比较基因组学、基因克隆、物理图谱构建等 方面具有广泛的应用前景。
玉米B染色体特异片段荧光原位杂交结果 A为中期染色体，B为间期细胞核
B480在玉米中期和间期细胞(2n=20+4B)中的 原位杂交定位
B1320在玉米中期和间期细胞(2n=20+6B)中的 原位杂交定位
4、单条染色体AFLP分子标记图谱分析
单条染色体AFLP分子标记图谱分析，可以直接获
得任意一种植物特定染色体分子标记图谱，利用
非常广泛的应用。
PALM激光显微切割系统
PALM激光显微切割系统操作界面
5、手工切割法：此法主要步骤包括： a、染色体制备，常规制备的中期染色体即可； b 、染色体显微切割，在倒置显微镜下配置显微切割 器 ，并将制备的硅化玻璃针安装在切割器上，把染 色体标本置于载物台上，在显微镜下找到待切割染色 体标本，操作玻璃针进行切割； c、切取染色体片段进行原位裂解和体外扩增。
容易对切口附近的染色体DNA造成较大损伤。 • 玻璃针法较为成功，但难以对染色体进行精确 的定位切割。王槐等研究了一种由激光微束与 玻璃针结合使用来切割分离植物染色体片段的
方法。
• 优缺点
• 盖玻片的存在减少了切割过程中外源DNA分子
的污染，且为油镜下更准确地识别目的染色体
和定位切割靶点创造条件，切割准确；
RNA等用于Western Blot、Southern Blot、Northern
Blot、PCR等蛋白质和核酸的相关分析。
• 显微切割的影响因素
• 最终结果的因素多种多样。
• 在实验过程中把握一个原则,即一切与显 微切割结合的技术中影响因素应同时列 为显微切割实验最终结果的影响因素， 在实验的过程中予以考虑。 • 与不同的方法结合决定了需要对显微切 割的材料进行不同的处理。
A B
A
A.分离前水稻细胞,箭头所指为4号染色体 B.分离4号染色体后的细胞
A
B
黑麦B-染色体(箭头所指)的显微分离 A. 分离前的核型(2n=14+2B) B. 分离出一条B-染色体后的核型
黑麦1R染色体的显微分离
③染色体特定区的显微切割
黑麦B染色体端粒区的显微切割
A
B
A. 显微切割前的黑麦完整核型（箭头所示为B染色体） B. 显微切割后的核型（箭头所示为切除端粒片段的位置）
3、扩增产物的原位杂交分析
• 利用荧光原位杂交技术可直接将某个区
段的DNA直接定位在染色体上，进行PCR
产物的鉴定。同时还可以将某个区段DNA
定位到相关的其它植物染色体上，进行
染色体“一对一”的杂交和进行单条染
色体之间的比较作图研究。
黑麦A、B染色体着丝粒区DNA同源性的 荧光原位杂交分析
黑麦A、B染色体端粒区同源性的 荧光原位杂交分析
分离前
分离后
单 条 染 色 体 技 术 流 程
AFLP
染色体C1、C2扩增电泳结果
从左至右依次为： M： Marker A： 拟南芥基因组DNA N： 负对照
C1：染色体C1DNA
C2：染色体C2DNA
单条染色体AFLP技术存在的问题
单条染色体DNA模板含量较低，为扩增增添 了不稳定因素
染色体的个体能准确地识别，而且可使切割的精确
度达到0.3微米。
1.玻璃针的制备
玻璃针拉制器将玻璃管拉成合适粗细的玻璃针
利用弯针器将玻璃针弯成合适的弯度
2.染色体的微切与分离
①全细胞染色体的分离
②特定单条染色体的分离 ③染色体特定区的显微切割
① 水稻基因组全细胞染色体的分离
②特定单条染色体的显微分离
• 显微切割的结合技术
• 能与多种分子生物学、免疫学、遗传学及病理学技术
结合应用，使显微切割技术显示出蓬勃的生命力。 • 根据研究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫 组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、FISH、 组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行标记。
• 显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和
260nm，无热效应产生，不会损坏材料；样品
可长时间保存。
• 但仪器及薄膜价格极为昂贵。
• PALΒιβλιοθήκη Baidu激光显微切割系统
• 由德国PALM公司研发的一套高级精确的实验室
设备。利用337纳米的紫外激光对显微镜下的
生物样本（组织，细胞簇，单细胞，染色体，
染色体片断等）进行切割和分离。在病理学，
遗传学，肿瘤学、植物学等多个科研领域得到
黑麦B染色体着丝粒区域微切过程
微切前
微切后
• 微操作机器人系统
• 微操作系统作为MEMS（微 机械电气系统(MicroElectro-Mechanical Systems）研究领域的一个 重要分支受到各发达国家 的高度重视，纷纷投入大 量资金进行微操作机器人 系统的研究，现已研制出 多种各具特色的微操作机 器人实验样机系统。
在理论上，遗传标记之间1cM的距离已连锁非常紧 密。因此，应用染色体显微切割和分离技术建立特定 染色体区段的DNA文库，已成为筛选与基因紧密连锁的 分子标记和基因克隆的有效方法之一。
染色体显微切割的方法主要有5种：流式细胞分类 器法、微细玻璃针法（手工操作法）、激光切割法、 玻璃针-激光法和激光捕获微分离法。此外，目前开始 尝试使用微操作机器人系统。
• 一是“细微”，显微切割的对象可以达到微米 级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此 利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和染 色体特异区带这样细微的对象；
• 二是“原位”，利用显微切割技术是在组织细 胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位 清楚，所研究对象的历史背景明确。 • 三是“同质”，显微切割技术可以保证所取材 料一定层次上的同质性。 • 四是“结合”，显微切割技术可以与多种分子 生物学、免疫学及病理学技术结合使用。
术分离了番茄第二号染色体。
• 优缺点
• 使实验过程机械化，可用于处理大批染色体。 • 但结构相似的染色体难以分开，使有些文库中 其它染色体污染率高达10-50%，不能构建染色 体区带特异性文库。
• 3、玻璃针-激光法
• 由于激光显微切割法需要价格昂贵的特殊培养
皿，操作也较复杂。且氩离子激光热效应大，
• 因为用玻璃针分离切割后的染色体，所以用普
通载玻片即可进行染色体制备，费用较低；
• 但仍需借助玻璃针的操作，易污染。
• 4、激光捕获微分离法
• 它是一种将紫外激光束切割与激光压力弹射相 结合的新方法，激光聚焦点直径小于1um，是
目前最为先进的技术，它使染色体显微切割操
作步骤大大简化。
• 将超薄膜用胶带封固在干净的载片上，紫外消
染 色 体 显 微 切 割 技 术 出 现 于 20 世 纪 80 年 代 。
Scalenghe 等（ 1981 ）首次报道了应用特殊玻璃针对
果蝇唾液腺染色体进行切割、分离和显微克隆。因为 当时尚没有发明 PCR 技术，需分离数百条染色体才可 获得足够数量的DNA。 PCR技术发明之后，Lü decke等（1989）将PCR技 术应用到染色体显微切割和克隆中，仅用少量切割片 段就获得了足够数量的DNA。
染色体标本制备及分离过程中可能会对DNA 造成损伤
Thank you!
结束放映
1、激光切割法
此法与手工操作法的主要差别在于：用激光束代 替玻璃针，将染色体标本上不需要的片段剔除， 然后将剩余染色体片段消化、扩增。Fukui等利 用此法成功地切割了植物染色体片段，但是该方 法对设备要求较高，激光切割区域对DNA分子也
有损伤。
2、流式细胞分类器法：
• 流式细胞分类技术分析和分选染色体是分子生 物学和遗传学研究的一个非常有效的方法。 • 1983年至1986年，美国的两个实验室用流式细 胞分类器和分子生物学技术建立了人类24种染 色体特异性的基因文库。也有学者利用此项技
• 显微切割技术是在显微状态或显微镜直 视下通过显微操作系统对欲选取的材料 （组织,细胞群，细胞，细胞内组分或染 色体区带等）进行切割分离并收集用于 后续研究的技术。 • 显微切割技术实际上属于在微观领域对 研究材料的分离收集技术，因此应用此 技术往往是许多要深入的研究工作中起 始的重要一步。
• 显微切割的特点
自1989年以来，染色体的显微切割技术的研究成
果主要是人类染色体区带特异探针池的构建，采用玻
璃针法已相继构建了一系列人类染色体区带探针池。
时至今日，植物染色体分离技术也已经发展成熟 ，并成为构建染色体特异区段DNA探针池最为有效和直 接的技术手段，例如，应用显微切割技术可以获得长 度为1～3Mb的DNA片段，相当于水稻基因组遗传图谱上 1～3cM。
• 生物工程作为微操作机器人系统的主要应用领 域。把生物工程作为微操作机器人的应用领域， 目的可以解释为2点：①从应用层面说，目标 相当明确地界定在“面向生物工程”上，如细 胞操作、基因转移、染色体切割等，希望给下 一世纪中国的“绿色革命”带来推动作用。② 从技术层面说，定位在基于显微视觉全局闭环 的计算机伺服自动协调作业上。长远观之，其 相关技术与微加工、微电子、显微医学等可触 类旁通。
毒，染色体制片。
• 用激光脉冲将靠近目标染色体的不需要的遗传
材料选择去除。
• 围绕目标染色体，用激光脉冲切割薄膜，通过 激光压力弹射操作仪将切下的薄膜上的目标染 色体弹射到距载玻片小于1mm的收集装置上， 如果所需目标染色体数目多且相同，则可收集
到同一个收集装置上。
• 优缺点
• 除具有激光微切割的优点之外，还在一种环境 中操作，避免了污染； • 激光波长为337nm，远离DNA最大吸收波长
• 系统的具体运作方式：
• 活体细胞或染色体悬浮在培养液内，左 右微操作机器人对称地安装在显微镜机 架上，毛细玻璃管与毛细玻璃针等操作 工具作为机器人的末端执行器(毛细玻璃 管用于捕捉与固定细胞，毛细玻璃针用 于细胞的切割、注射等)。
哈工大纳米级微驱动及微操作机器人平台
纳米微操作机器人在10×10微米的基片上刻出的字样
这些相同的DNA分子标记，在相关的物种之间进行 遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因 组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上基 因及排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物
种的基因结构和起源进行分析，为基因的克隆、
基因组的比较研究、遗传图谱和物理图的构建提 供一个新的方法。
洋葱染色体分裂相