HIV核酸检测技术及应用

常用的病毒载量检测方法
主要核酸扩增和信号放大扩增两种方法 Q (,生物梅里埃) (，罗氏) m2000(，雅培) 440 (西门子) 国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北
制药、万泰 丽珠、科华等
血浆样本
病毒载量分析仪
扩增技术 （ ,核酸序列依赖性扩增法）
引物1 延伸
逆转录酶 H和 引物 2延伸 逆转录酶 T7 聚合酶
初筛+复检+
补充试验（核酸试验）
定性检测试剂盒
试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批 准、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。全球 目前正式用于临床诊断1 急性期感染的核酸检测试 剂比较少 公司生产的 1 核酸定性试剂盒 公司生产的M2000 1 定性检测试剂盒 公司生产的® ® ® 1 2.0
核酸检测在新版规范主要内容
u 新增补充试验的概念，补充试验包括抗体确证试验和核 酸试验（定性和定量试验）
u 新增核酸检测流程，对复检结果有反应的情况，增加了 可以选择核酸诊断的策略；对于抗体确证结果不确定和 疑似急性期感染的样品建议采用1 核酸试验。
u 修改了艾滋病感染产妇所生儿童感染早期感染检测流程
感染的自然史
急性感染期 无症状期 艾滋病期
感染后标志物变化时间
Reactivity
HIV RNA
p24 Ag
IgM AntiHIV
IgG Anti-HIV
012345678
Weeks post-infection
核酸检测的意义
耐药性 艾滋的“元凶”
核酸
缩短窗口期
指导治疗
病程 自然史
核酸检测的意义
核酸检测技术及应用
目录
核酸简介 核酸检测意义 核酸检测技术现状与发展 核酸检测质量控制 核酸检测流程（新规范） 核酸检测实例应用
病毒
病毒颗粒：呈球形，直径100-120 病毒衣壳：呈20面体立体对称 病毒核心：由（两条）、核衣壳蛋白、逆转录酶、核糖核酸酶及整合酶所组成
前病毒
生活周期图
阳性：扩增出人β，1 、和基因中扩增出2个及以上基因片段 阴性：扩增出人β球蛋白基因，1 、和 3个基因都没有扩增出来 不确定：人β球蛋白基因未扩增出预期的片段或1 、和 3个基因只扩 增出一个
“套式”
5’ gag
第一轮PCR 产物
pol
env
3’
AAAAAA
Reverse primer 1 Forward primer 1
1感染诊断
婴儿感染早期诊断（小于18月龄）
1感染补充试验及急性期和晚期感染者的诊断
治疗效果监测
通常在治疗一个月后病毒载量降低0.5以上才
被认为临床治疗有效，六个月后应降到小于检测限
病程监控及预测
耐药性监测
核酸检测技术
分为定性和定量检测两大类： 定性检测：核酸（和前病毒）的检测 定量检测：又称病毒载量检测（ ），主要 用于抗病毒治疗患者的疗效评价，也可用于 补充试验（新规范）
A
200000 150000 100000
50000 0 0
FAM CY5
10
20
30
40
50
60
Cycle Number
核酸阴性
B
400000
300000
FAM CY5
200000
100000
0
0
10
20
30
40
50
60
Cycle Number
核酸阳性
罗氏1
基于® ® / ® 48平台，用于1 和前病毒的定性诊断， 检测样本类型包括抗凝全血、血浆、血清、干血斑或干 浆斑等
Q R
探针被5’-外切核酸酶切掉
h
Q R 报告基团的荧光发射
R = 报告基团 Q = 淬灭基团
雅培1病毒载量仪
m2000全自动实时荧光定量系 统
1病毒载量自动化检测平台 （96通量）
已认证用于干血斑病毒载量检 测
婴儿1核酸检测试剂盒
用于实验室方法的自动化核酸 提取
此平台同时有病毒载量，病毒 载量及分型，高危分型，检测， 检测等试剂盒
Reverse primer 2 Forward primer 2
第二轮PCR 产物
优点: 增加敏感性/特异性 缺点: 增加扩增偏差机会
需要增加操作过程 容易增加污染机会
琼脂糖凝胶电泳
β
荧光
国内外文献报道以 或前病毒作为检测目标， 选择、、等基因作为靶基因，建立荧光检测方法
Deltan Rn Deltan Rn
()
核酸信号的放大！而非核酸分子的扩增！
•临床式半自动使用方案
北京万泰生物药业股份有限公司
•自动化提取
•人工加样 •试剂分装
•人工配液 •仪检测
核酸定量检测试剂-全自动化平台
全自动核酸提取仪
仪结果导入
检测
Ø 强强联合整合加样与核酸提取平台
Ø 高通量 同时可用，实现1h内96份样本的提取
Ø 高自动化可自动完成包括加样、核酸提取与纯化、试剂配制与分配等扩增前的所有操作
Ø 采磁棒转移技术，有效避免气溶胶污染
Ø 中文自主操作界面，方便快捷
达安基因病毒载量核酸检测系统
•DA3200
•HIV-1核酸定量检测试剂盒 •全自动核酸提取仪 •国产化！全自动！
系统——（转录介导的等温扩增）
简易的工作流程：“上样”直接到“结果”， 3.5小时得到第一个样本结果，每分钟一个结果， 12个小时500个样本
T7启动子序列
逆转录酶 引物 2
(鸟肉瘤病毒逆转录酶):延伸形成 杂交链 H:降解杂交链中的 T7聚合:转录形成的转录产物
H 引物 1
逆转录酶
逆相 扩增物
T7 聚合酶
“分子信标” 杂 交
® ® / ® 48
® ® / ® 48® 系统
水解探针技术
引物
h
Q
R
引物
完整探针: 报告基团 (R) 的 荧光被淬灭基团(Q)抑制
核酸定性检测
u （文献报道） u 1 , v1.5试剂盒(已停产) u ® ® ® 1 2.0 u 雅培 1定性检测试剂盒 u 病毒储存库的检测技术（超敏）
普通诊断方法
核酸提取
或扩增
电泳鉴定或测序
1的基因组结构
~9.2 结构蛋白
酶类
衣壳蛋白
普通诊断方法
检测设计：分别针对 、和的三个独立检测体系，并另外设立1个 检测内参（β）的检测体系（国家艾滋病参比实验室）
® ® ® 1 , v2.0
: 1 ’s
a
: a
检测总核酸（）
检测结果示例
阴性 阳性
核酸定量检测
病毒载量( ) 指体内复制的病毒的数量，反映体液
（一般是血浆）中病毒的含量 1987年首次提出病毒载量（ ）的概
念，体内复制的病毒的数量是不能直 接测量的，一般用血浆中 的拷贝数 代表的病毒载量。 是核酸的定量检测，一般以血浆 的 拷贝数表示