细菌种属的分子鉴定

用16S rDNA方法鉴定细菌种属

一、目的

1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；

2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。

二、原理

随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线：

三、操作步骤

（一）细菌基因组DNA提取

1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。

2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。

3. 加140 μL TE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。37℃放置10分钟。

4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。

5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。

7. 重复第六步。

8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。

9. 加入50 μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的

液体即为基因组DNA。

10. 电泳。取3 μL溶液电泳检测质量。

（二）PCR扩增

1. 根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物。

16S (F) 5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'

16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

2. PCR扩增体系：

在0.2 mL Eppendorf管中加入1μL DNA，再加入以下反应混合液：

16S (F) 1μL (10μM)

16S (R) 1μL (10μM)

10×PCR Buffer 5 μL

dNTP 4 μL

Taq酶0.5 μL

加ddH2O使反应体系调至50 μL，简单离心混匀。

3. PCR反应

将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为：

94℃ 3 min

94℃30 sec

50℃45 sec 35 cycles

72℃100 sec

72℃7 min

4. PCR产物的电泳检测

拿出Eppendorf管，从中取出5 μL反应产物，加入1μL上样缓冲液，混匀。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳1 hr。在紫外灯下检测扩增结果。

（三）扩增片段的回收

根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。

1）称量一2 mL.的Eppendorf管质量，记录。

2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的Eppendorf管内，称量。计算凝胶质量。3）每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。60℃温育至凝胶融化

4）全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

5）加入500 μL Binding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6）加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。

7）再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。

8）加入30 μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。

（四）DNA片段测序

将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。

四、实验结果及分析

根据测序结果，到NCBI上进行比对，确定该未知菌的种属。

()

根据比对结果进行进化树的绘制。写明所用软件及大致的分析方法。

分析讨论实验的过程及结果。