鱼类转基因技术

《生物工程进展》2001,V ol.21,N o.3

鱼类转基因研究

王进科

(南京师范大学生命科学学院水产科学研究所,南京　210097)

摘要　本文综述了鱼类转基因研究的意义、鱼类基因转移研究的特点、转基因鱼的构建及检测技术、我国鱼类转基因研究的进展和鱼类基因转移研究中存在的主要问题。

关键词　鱼类　转基因

1　转基因鱼的意义

鱼类是人类食物消费中比普通家畜更为偏好的重要蛋白质来源,发展和完善鱼类基因转移技术,将有用的鱼类基因,如生长激素、干扰素、抗寒性、抗病性及抗盐性等基因导入鱼卵可改良鱼类性状,为培育高产、优质及抗逆的养殖鱼类新品系提供新途径。转基因鱼研究虽稍晚于哺乳类,但由于鱼类基因工程育种本身所具有的潜在经济价值和作为转基因研究所具有的有利条件而取得重大进展,转基因鱼是目前国内外获得最成功的转基因动物之一。自80年代后期开始,国际上掀起了鱼类基因转移研究的高潮,20多个实验室以不同的鱼为对象,相继投入这一领域的研究,取得了不同的进展[28]。转基因鱼首先产生于中国[4][8][9],之后英国、法国、加拿大、爱尔兰、德国、美国也先后进行了转基因鱼的研究(表1),转基因鱼研究已成为鱼类品种改良的前沿生物技术。

表1　成功的鱼类基因转移

鱼种外源基因(启动子Π目的基因)文献鲫鱼Carassius auratus(G old fish)m MTΠhG H朱作言等,1985泥鳅Misgurnus anguillicaudatus(Loach)m MTΠhG H朱作言等,1986青　Oryzias laticeps(M edaka)S V40ΠcCr Ozato et al.,1986虹鳟Oncorhynchus mykiss(T rout)S V40ΠhG H Chourrout et al.,1986美国沟鲶Ictalurus punctatus(Catfish)m MTΠhG H Dunham et al.,1987虹鳟Oncorhynchus mykiss(T rout)m MTΠrG H M aclean et al.,1987大西洋鲑Salmo salar(Salm on)m MTΠhG H R okkones et al.,1989大西洋鲑Salmo salar(Salm on)fAFPΠfAFP Fletcher et al.,1988斑马鱼Brachydanio rerio(Z ebrafish)S V40ΠHygro S tuart et al.,1988大西洋鲑Salmo salar(Salm on)m MTΠβ2G al M cEv oy et al.,1988大西洋鲑Salmo salar(Salm on)m MTΠrG H M cEv oy et al.,1988罗非鱼Oreochromis niloticus(T ilapia)m MTΠhG H Brem et al.,1988斑马鱼Brachydanio rerio(Z ebrafish)S V40ΠCAT S tuart et al.,1988青　Oryzias laticeps(M edaka)m MTΠrtG H Inoue et al.,1990青　Oryzias laticeps(M edaka)F LusΠF Luc T am iya et al.,1990虹鳟Oncorhynchus mykiss(T rout)cCΠcC Oshiro et al.,1989金鱼Carassius auratus(G old fish)RS VΠCAT Hallerman et al.,1990鲤鱼Cyprinus carpio(C omm on carp)RS VΠrtG H Zhang et al.,1990白斑狗鱼E sox americanus G melin(Pike)RS VΠbG H G uise et al.,1991泥鳅Misgurnus anguillicaudatus(Loach)m MTΠhG H Benyum ov et al.,1989北美沟鲶Ictalurus punctatus(Channel catfish)RS VΠbG H Schneider et al.3鲤鱼Cyprinus carpio(C omm on carp)S V40ΠbG H朱作言等,1988鲤鱼Cyprinus carpio(C omm on carp)RS VΠbG H朱作言等,1988金鱼Carassius auratus(G old fish)RS VΠNeo Y oon et al.,1990虹鳟Oncorhynchus mykiss(T rout)RS VΠtG H(cDNA)P owers et al.,1990鲶Ictalurus punctatus(Catfish)RS VΠrt G H P owers et al.,1991鲤鱼Cyprinus carpio(C omm on carp)m MTΠhG H P owers et al.,1991鲤鱼Cyprinus carpio(C omm on carp)m MTΠhG H Hernandez et al.,1991泥鳅Misgurnus anguillicaudatus(Loach)m MTΠhG H X ie et al.,1989鲤鱼Cyprinus carpio(C omm on carp)m MTΠhG H X ie et al.,1993

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2　鱼类转基因特点

利用鱼类受精卵系统做基因转移比哺乳类动物的相应系统有无可比拟的优越性。鱼类怀卵量多,易获得大量基因转移受体;在室温下干净的水中即可完成胚胎体外发育,操作方便,易于培养、管理和观察;鱼类发育至幼鱼的时间短,可以用改变环境温度控制其发育速度,是研究发育过程中基因调控与表达等生物学问题的理想材料。另外鱼类是脊椎动物系统发育较原始的类群,不同种属,甚至在不同科之间,容易亲和协调,因此鱼类在接受外源基因和外源基因表达方面较高等的种类更有利。

3　转基因鱼的构建及检测

转基因鱼研究首先是构建外源基因。转基因鱼研究早期使用m MT、S V40和RS V等表达效率低而且存在安全性顾虑的外源基因启动子,及人、牛、羊和鼠的生长激素(G H)基因[4][6][12][19][26][27][28]构建目的基因,之后克隆了鱼类自身的高效启动子[36][37]和鱼类生长激素[4][15][9][18][30][34][40][48][54][55][56][59]、抗冻蛋白基因(AFP)[16][17][20][21][25][39]、珠蛋白(G lobin)基因[29],并进行了全鱼基因的转基因鱼研究[36][66]。

G H基因和AFP基因为鱼类转基因研究的两个热点基因[2]。转基因鱼中基因导入受体卵中的方法较多,有显微注射法[4][7][19]、电穿孔法[23][32][41][63]、精子载体法[1][10][11][13][42]、基因枪法[62],其中最常用的是显微注射法。转基因鱼的检测依据基因整合及基因表达采用不同的检测方法,运用斑点杂交和PCR法可检测出含有外源基因的受体鱼;采用S outhern杂交作进一步检测来确定外源基因是否真正整合入受体鱼基因组[43];N orthern杂交或RT-PCR可用来检测外源基因的转录;采用组织提取液酶活性[47]或标记特异性抗体与组织提取液或血清等进行免疫学反应可推断外源基因的表达水平。

4　我国转基因鱼研究的进展

转基因动物工程是80年代开展起来的一项遗传育种高新技术,我国在这一领域率先进行了鱼类转基因研究,于1985年生产出了世界上第一批转基因鱼[64],之后许多国家相继开展了鱼类转基因研究,在短短几年中,取得了很大的进展。我国的鱼类转基因研究处于世界领先水平。

1985年朱作言等在国际上首先进行了鱼类转基因研究[64],采用显微注射方法,把小鼠重金属结合蛋白(MT-1)基因启动序列与人生长激素基因序列的重组DNA片段,注入鲤鱼(Cyprinus carpio haematopterus T em.et Schl.)(包括镜鲤和红鲤)、鲫鱼(Carassius auratus Linnaeus)、银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)和泥鳅(Misgurnus angullicaudatus Can2 tor)受精卵,对注射外源基因受体鱼进行斑点杂交和S outhern杂交,检测外源基因在受体基因组中的整合率,约50%个体呈杂交阳性,表明外源基因能整合到受体鱼基因组中;用放射免疫测定表明接近50%的幼鱼肌肉组织匀浆上清液样品和成鱼血清样品中含人生长激素,幼鱼体内人生长激素含量明显高于成鱼,说明转基因鲤鱼和鲫鱼具有合成人生长激素的能力,从而使转hG H基因泥鳅体重剧增,转hG H 基因银鲫、镜鲤同样表现出快速生长效应。研究表明外源基因导入受精卵后随受体胚胎发育以多种物理构型进行复制扩增,至胚孔封闭期达到高峰,此后,扩增的大部分外源基因逐渐降解,只有小部分在胚胎发育晚期与受体基因组整合,由此形成转基因鱼个体。研究还证实外源基因整合是发生在胚胎主要器官分化以后的一个渐进过程,由此形成的转基因鱼是携带外源基因的嵌合体,即不同组织或器官之间,同一器官的不同细胞之间所整合的外源基因在数量和位点上是不均一的。从繁殖的转基因鲫鱼和鲤鱼子一代证实外源基因可以通过生殖细胞传递给后代,但由于转基因鱼亲本是携带外源基因的嵌合体,应通过雌核发育及生理转性技术缩短建立纯系的世代周期,将外源基因有效整合和最适表达的个体稳定成为经济性状优良的养殖新品系,该研究首次建立了一个高效、简洁而且完整的转基因鱼模型[7][8][9],它为鱼类基因工程定向育种新技术奠定了实验基础。运用非鱼基因元件构建转基因鱼并应用于生产实践,由于心理和伦理上的原因,消费者难以接受,针对这一问题,提出了构建“全鱼”基因的设想,先后分离和克隆了鲤鱼、草鱼β2肌动蛋白基因(C A)和草鱼生长激素(gcG H)基因及其cDNA,并将草鱼C A基因5′端启动调控区与gcG H基因3′端下游结尾区重组,构建了我国鲤科鱼类基因高效表达载体pC Az。在此基础上,将gcG H结构基因或cDNA 顺序分别与pC Az载体重组,构建出全部由我国鲤科鱼类基因元件组成的“全鱼”G H基因重组体pC A gcG H和pC A gcG Hc,并应用于转“全鱼”基因鱼的培育,获得了快速生长20%～30%的鲤鱼和银鲫[66],建立了进入中试阶段的转基因鱼群体。“全鱼”G H 基因的构建和应用,使转基因鱼研究向实用化的目

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