转基因鱼

6754 bp
Common carp beta-actin promoter
Hin dIII (2877)
pCAsGnRHpc-antisense重组质粒（环）
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四、其他转基因技术 脂质体介导法：用与细胞膜结构类似的脂质体包
裹外源基因进行转移。
微粒轰击法：将外源基因包裹在钨粒或金粒表面，
然后将其发射到受精卵里的方法。
这两种方法还都不太成熟，还有待进一步研究。
转基因动物可能带来的问题 和解决方案
• 食品安全： 转“全鱼”基因； • 生态安全： 不育。
不育技术
之下，后一种方法效果更好，阳性率高。目前在这方面的研究很多，
如海水贝类、草鱼的转基因等。 优点：电脉冲基因转移法操作简单，重复性好，适于大规模生产， 缺点：阳性率有待进一步提高。
四、其他转基因技术
除上述几种主要的基因转移方法以外，还有其它一些基因 转移方法，如：磷酸钙-DNA共沉淀法、反转录病毒介导法、脂
胞正常的减数分裂，结果常常导致性腺不
能发育。
• 在杂交三倍体，即种间杂交受精卵通过三 倍体诱导技术处理而培育出的三倍体，其 不育性更高于普通三倍体。
三倍体的优点
有些种间杂交二倍体的生存率非常低，甚 至不能成活，但杂交三倍体都能恢复生存 性。这一特点大大提高了杂交三倍体的实
用价值，这样就可以通过诱导杂交三倍体
转基因鱼的生态安全对策研究方法主要有：
—— 地理隔离 （成本大，风险大)
—— 人工诱导三倍体 （100%的效率？）
—— 倍间杂交 （多倍体的培育问题）
—— 分子生物学方法 如 反义RNA技术、基因knock-out技术等
GnRH,GPR54
三倍体的培育
三倍体的优点
• 三倍体非偶数染色体组，故阻碍了生殖细
优点：转移的基因大小不受限制，效果比较稳定。 缺点：技术要求高、工作量大、操作的最适时机
短暂，不适于向发育后期的胚胎转移基因。
二 精子携带法 精子携带法是以精子为载体，将转植基因定向地导入受精卵的细胞
核。Brackett等在1971年最先观察到精子可以将外源DNA转入兔的卵子
。1989年，Lavitrano用小鼠做实验开创了用精子介导法进行转基因的先 河。Khoo等在1992年将此法应用于斑马鱼，我国也有该方法成功获得
体，待四倍体个体性成熟后再与二倍体个
体自然交配，获得三倍体。
生物学方法产生4倍体
生物学方法通过鱼类远缘杂交，异源精子可以诱发受精 卵产生多倍体，这种由于远缘杂交染色体自然加倍的现 象，称为生物学方法。
利用这一方法可以获得三倍体和四倍体鱼类，如鲫（♀）
×鲤（♂）杂交的杂种二代（F2）是二倍体，F2（♀） ×F2（♂）自交后产生的F3是四倍体，往后的F4、F5乃 至F6都是四倍体，已经形成了稳定的四倍体种群。利用 这一四倍体种群与二倍体鱼杂交，可以获得具生长优势
pCAsGnRHpc-antisense反义RNA表达载体
Eco RI (6520)
grass carp GH 3'UTR
NcoI (5733)
Aat II
antisense sGnRH partial cDNA
Cla I (5420) Nco I (5405)
pCAsGnRHpc-antisense
点整合或靶基因的定点修饰，避免外源基因在基因组中随机整合可能带
来的不利影响。 基因靶位操作需要在培养细胞中进行，要获得靶基因定点修饰的动
物个体，必须建立从细胞到动物个体的技术途径。
• Knock in； • Knock out； • Knock down。
基因转移方法
一、显微注射法
二、精子携带法
质体介导法和微粒轰击法等。
磷酸钙-DNA共沉淀法：原理是改变细胞膜的通透性，以增 强细胞从培养液中摄取外源DNA的能力。此方法的优点是操作简 单，缺点是转移效率不高。
反转录病毒介导法：利用反转录病毒为载体，介导基因转 移。这方面的研究不多，主要用于禽类的转基因研究。其优点 是转染效率高，但病毒载体对外源基因的容量小，难以满足研 究的需要，病毒载体还有重组成致病性病毒的可能。
的三倍体鲤鱼和三倍体鲫鱼。
三倍体的产生的问题 和解决方法
• 雌鱼不育； • 雄鱼可育；
• 三倍体雌鱼的培育：结合雌核发育、 性别转变和三倍体诱导技术。
• 作业：如何诱导三倍体雌鱼？
现代基因工程的方法产生的不 育技术
—— 分子生物学方法 如 反义RNA技术、基因knock-out技术等
Gene
调控元件 编码序列 终止序列
• 1999 年美国的斑蝶事件。转基因的抗虫玉米的花粉撒在了马 利筋杂草上面，而北美斑蝶以这种杂草为食，结果吃了携带 有转植基因的斑蝶幼虫，生长缓慢，也引起了少部分斑蝶幼
虫的死亡。斑蝶是北美一种珍稀濒危动物，所以在当时在全
世界都引起了很大的反响。
转基因的历史
Gordon（1980）将纯化的DNA(通过显微注射的方法导入小鼠 胚胎获得转基因动物，是现代生物学研究的里程碑；
转基因鱼的报道。
优点：操作简单，
缺点：阳性率低、不稳定等缺点。
精子携带外源DNA的机制还不十分明确，有待深入研究。
三 电脉冲基因转移法
电脉冲基因转移法的原理是通过电脉冲在细胞膜上产生短暂的 微孔，DNA就有可能进入细胞中，整合到基因组。具体有两种操作方 法：将DNA直接导入受精卵或先将DNA导入精子，再进行授精。相比
源有利于基因结构的破坏和失活,或激活有
害基因（如癌基因）。
基因靶位操作
基因靶位操作(gene targeting) 20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术。它是指通过 外源DNA与染色体DNA间的同源重组，定点修饰和改造基因组特定位点 的技术。基因靶位操作技术的出现，使转基因动植物和生物反应器研制 更为精确，转植基因将准确插入受体基因组靶位点，实现转植基因的定
研究背景—

转基因鱼的安全性
众所周知，渔业产品是人类重要的蛋白质来源，其快速生长和品质改
良一直是育种工作者所追求的目标;

1985年，朱作言等将重组人生长激素基因通过显微注射方法转入金鱼
受精卵，在世界上首次培育出具有快速生长效应的转基因鱼；
随后，许多淡水和海洋鱼类被用于转基因研究．目前，转基因鱼研究 主要聚焦在提高生长速度、增强抗病能力、改善中间代谢等; 建立快速生长转基因鱼品系是转基因鱼育种研究的一个重要方向；同 时快速生长转基因鱼的产业化也备受关注。由于涉及到转基因生物的 安全性问题，迄今为止还没有转基因动物商品化的报道。
化学方法诱导三倍体
化学方法用秋水仙素、细胞松弛素B等化学 药品在适当时刻处理鱼类受精卵，可以抑 制第二极体外排或抑制第一次有丝分裂。 从而达到产生三倍体或四倍体的目的。应 用这一方法在国内外都有成功的实验报道， 但由于这些化学物品价格较贵，且有毒性， 故很少在生产上应用。
如何获得三倍体鱼？
一条是直接途径，即用物理或化学的方法 对受精卵进行处理，阻碍第二极体外排； 另一条是间接途径，即首先诱导获得四倍
如何获得三倍体鱼？
一条是直接途径，即用物理或化学的方法 对受精卵进行处理，阻碍第二极体外排； 另一条是间接途径，即首先诱导获得四倍
体，待四倍体个体性成熟后再与二倍体个
体自然交配，获得三倍体。
大多数鱼类在精子入卵后8～10min，就可
完成第二次减数分裂，排出第二极体，
45～50min就可完成第一次有丝分裂。如需
带有人生长激素基因的 转基因小鼠 正常小鼠
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外源基因的载体
从 基 因 到 蛋 白 的 转 录 和 翻 译 过 程
转基因动物的一般制备过程
转基因 动物的 一般制 备过 程。
转基因动 物的一般 制备过程 （续）。
转基因技术的缺点
外源DNA引入受体细胞后可以随机地插入
受体细胞基因组中的任意位置,容易导致内

Palmiter和她的同事（1982）将生长激素注射到小鼠卵，获得 明显表型效应的转基因巨鼠 ；
1985年，朱作言等将重组人生长激素基因通过显微注射方法转入鲫
鱼的受精卵，培育出首例具有快速生长效应的转基因鱼。
1994年美国Calgene公司推出的转基因耐贮番茄品种Flavr Savr。 通过分离其与乙烯代谢有关的氨基环丙烷羧酸（ACC）合成酶 基因，然后再将其反向(反义)导入番茄，从而抑制乙烯的合成。 转基因作物的果实长期保持绿色硬实，所以易于运输和贮藏。 上市之前，用外源乙烯处理，果实就成熟变软，其颜色和风味 如常。
研究背景—
转基因鱼的安全性
转基因鱼生物安全性主要包括两个方面
食品安全和生态安全。
转“全鱼（all-fish）”基因概念的提出，使得转基因鱼作为
渔业产品的食用安全性问题已基本解决；在这样一个前提下，
如何解决转基因鱼的生态安全性问题显得尤为重要，同时也是 转基因鱼实现商品化的重要保障。
研究背景—
转基因鱼的安全性
获得三倍体，就要在完成第二次减数分裂
以前进行诱导处理。
温度诱导三倍体
必须严格控制处理的起始时间和持续时间。 如美洲红点鲑，卵受精后15min用28℃高水 温热休克处理10min，诱导出100％的三倍 体，孵化率为42％。对蛙胡子鲶而言，在 25±1℃下卵受精5min后，放人5℃海水冷 休克处理1h，然后放入充气海水中培育， 结果获得100％的三倍体仔鱼，如果处理时 间在1.5h以上，则造成100％的死亡率。
三、电脉冲基因转移法
四、基因靶位操作
五、其他转基因技术 如：磷酸钙-DNA共沉淀法、反转录病毒介导法、 脂质体介导法和微粒轰击法等。
一 显微注射法
显微注射法最早由Gordon发明，是将重组DNA直接 注射到第一次卵裂前的受精卵动物极细胞质内（鱼类） 或雄性原核（哺乳动物）中。这是使用最广泛、效果
最好的一种方法。
来组合二倍体杂交不成功的两个种类间的
优良性状，如抗病性、温度耐受性、快速
生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ等。
三倍体的优点
不育的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段
性腺发育的能量损耗，所以有以下优点：避 免了性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降； 避免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增 加；缩短了养殖周期，减少了养殖成本并可 养成大型个体。
转基因鱼
• 改善的鱼类新品种, 以提高其生长速度和饲 料转化率、改善品质、增强抗性等;
• 转基因鱼可作为生物反应器表达生产重要 药物或生物活性物质; • 通过转基因改变观赏鱼的表型提高其观赏 价值等。
转生长激素的鱼
转生长激素的鱼
转荧光蛋白基因的鱼
彩色转基因鱼
转基因食品被质疑
• Pusztai事件(普斯陶伊事件）。1998年秋天，英国Rowett研究 所Pusztai博士在英国电视台发表讲话时声称，大鼠食用了转 雪花莲凝集素基因的土豆后，发现部分老鼠的肾、脾。大脑 等器官收缩或发育不正常，免疫系统变弱，等等。