高效液相色谱系统ppt

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等度洗脱是在同一分析周期内流动相组 成保持恒定,适合于组分数目较少,性质 差别不大的样品
梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制 流动相的组成,如溶剂的极性、离子强度 和pH值等,用于分析组分数目多、性质差 异较大的复杂样品
梯度洗脱
低 压
B AC
梯D
度 比例阀
高压输 液泵
阻尼器 混合器
进样器
色谱柱
检测器
Agilent
1100 型
0.001~10 0.001~10
LC-10ATvp 型
Elite P200 II型
LC-5500 型
0.001~9.99 9
0.01~4.99
0.01~ 4.99
检定 要 求
调节精度
0.001
0.001
0.001
0.01
0.01
流量精密度 流量准确度
RSD 0.1%
0.15% (<0.3 0.3% %)
高压接头采用不锈钢材质 低压接头采用高聚物材质 • 连接件主要有卡套和空心螺钉
检测器
• 紫外检测器(包括二极 管阵列检测器)
• 荧光检测器 • 示差折光检测器 • 电导检测器 • 蒸发光散射检测器
重要指标:
噪声、漂移、线性、检出限
功能: 检测组分浓度
目标: 准确 检出限低
紫外检测器
❖原理:基于被分析组分对特定波长紫外光 的选择性吸收
❖定量基础:朗伯-比耳定律,A=KCL ❖优点: 1)灵敏度高
• 所用的溶剂纯度要求高 • 所用的溶剂要彻底脱气,防止混合时产生
气泡 • 混合溶剂的黏度常随组成而变化,因而在
梯度洗脱时常出现压力变化 • 每次梯度洗脱后必须对色谱柱进行再生处
理,使其恢复初始状态
高效液相色谱的配件
• 管路与连接件 • 脱气装置:在线脱气机或超声波清洗器 • 过滤器:溶剂过滤器和针筒式过滤器 • 进样器:平头进样器
• 通用型检测器(适合 于挥发性比流动相低 的任何组分);响应 值与组分质量有关; 可用于梯度洗脱
样品液滴
HPLC柱 喷雾气体 蒸发漂移管
激光光源
散射室 光二极管检测器
工作站
数据采集系统 功能: 采集处理数据
目标: 使用便捷 功能完善
梯度洗脱
●HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient) 洗脱两种方式
高效液相色谱系统
——液相色谱培训(二)
液相色谱流程图
储液瓶
高压泵
色谱柱
检测器
色谱工作站
进样器
高压输液泵

输液系统功能: 溶剂输送
目标: 稳定 准确
双柱塞往复式并联泵
重要指标: 耐压能力 压力脉动 流量精密度 柱 流量准确性
双柱塞往复式串联泵
各品牌输液泵的基本参数
项目 流速范围
Waters 515型
2)选择性好 3)对温度和流速不敏感,可用于梯度洗脱 ❖ 缺点:仅适用于测定可产生荧光的物质 ❖ 可检测物质:多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸 、卟啉、儿茶酚氨等(具有对称共轭体系)
示差折光检测器
❖原理:连续测定流通池中溶液折射率来测定试 样中各组分浓度。
❖优点:通用型检测器, ❖缺点: 1)对温度变化敏感 2)对溶剂组成变化敏感,不能用于梯度检测 3)属于中等灵敏度的检测器
±1.0% ±1.0% ±2.0%
0.5% ±5.0%
0.5%
1.5%
±2.0源自文库
±1.0%
%
最高压力
4000 Psi 40 MPa 39.2 MPa 40.0 MPa 40MPa
进样器
• 隔膜进样 • 停留进样 • 阀进样 • 自动进样
进样器
• 对进样器的要求 ➢密封性好 ➢死体积小
➢重复性好 ➢保证中心进样 ➢进样时对色谱系统的压力、流量影响小
不同材质的管路
• 不锈钢管:耐腐蚀性好,有精密的同轴度, 一般用于高压部分
• 聚合物管:用在液相色谱系统中从储液瓶 到泵、检测器出口以后和进样器排液口等 低压部分
• PEEK(聚醚醚酮)管:是一种耐高温、高 性能的工程塑料,具有良好的惰性,适宜 于生物样品的分离分析
液路连接件
• 连接件也称接头 • 一般可分为两种:高压接头和低压接头
进样器原理-六通阀
手动进样器-六通阀
• 一般HPLC分析常用六 通进样阀(以美国 Rheodyne公司的7725 和7725i型最常见),其 关键部件由圆形密封垫 (转子)和固定底座 (定子)组成。耐高压 (35~40MPa),进样 量准确,重复性好,操 作方便
分离系统 功能: 组分分离 目标: 分辨力强 效率高
电导检测器
❖原理:根据物质在某些介质中电离后所产生的 电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离 子色谱法
❖优点:对流动相流速和压力的改变不敏感,可 用于梯度洗脱
❖缺点:对温度变化敏感(每升高1度,电导率 增加2%-2.5%)
❖主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子
蒸发激光光散射检测器(ELSD)
色谱柱
液相色谱柱是高效液相 色谱仪的核心部分,是 分析好坏、成败的关键
键合相色谱柱
• 键合相: – 反相: 70%; ➢ C18, 65%; C8, 15%; 苯基柱 <5%, – 正相: 20%; ➢ 硅胶、 -NH2、 -CN、-OH – 其它 (手性柱, 离子交换柱): 10%
• 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。 • C18 和 C8 在反相色谱中应用得最为广泛。
紫外-可见检测器
大多数有机化合物有一定程度的吸光度,所以紫 外-可见检测器可以测定大多数的化合物,是目 前实验室中使用最多的检测器
--多数公司售出的检测器中75%以上是吸 光度检测器(其中50%以上是紫外-可见检 测器,25%是PDA)
荧光检测器
❖ 原理:基于被分析组分发射的荧光强度进行检测 ❖ 优点: 1)灵敏度极高,是最灵敏的检测器之一

高压输 液泵

梯 高压输
度 液泵
进样器
梯度混合器
色谱柱
检测器
梯度洗脱的特点
• 优点
– 缩短分析时间 – 增加分离能力 – 提高检测灵敏度
• 缺点
– 仪器设备要求高 – 不适合某些检测方式(RI) – 柱需再生平衡 – 定量分析的重复性较低
梯度洗脱注意的问题
• 注意溶剂的互溶性,不相混溶的溶剂不能 用作梯度洗脱的流动相
2)对温度和流速不敏感 3)可用于梯度洗提 ❖缺点:仅适用于测定有紫外吸收的物质
二极管阵列检测器
样品池 D2 / W 灯
光栅
每一组分可在每一波 长处得到一吸光度值
二极管阵列
二极管阵列检测器
二极管阵列检测器的优点
1)采集三维谱图 2)峰纯度检验 3)光谱库检索 4)可以发现单波长检测时未测到的峰
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