紫外诱变育种方案

紫外诱变大肠杆菌str(链霉素)抗性突变株的筛选

一、目的要求

1 、观察紫外线对链霉素产生抗性的诱变效应

2 、学习并掌握物理诱变育种的方法。

二、基本原理

紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。

经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。三、实验材料

(一) 菌种

大肠杆菌

(二) 培养基（完全培养基）

1. 肉膏蛋白胨培养基

牛肉膏 0.5 g

蛋白胨 1.0 g

NaCl 0.5 g

水 100 mL

pH 7.2

100 KPa 、121℃高压蒸汽灭菌20min。

如配制固体培养基需加琼脂1.5%～2%。

如配制半固体培养基则加琼脂0.7%～0.8%。

(三) 主要药品

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、链霉素。

(四) 主要器皿

试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。

四、实验内容

(一) 诱变

1. 菌悬液的制备

出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16～24h。

取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL 于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。

2. 平板制作

将肉膏蛋白胨培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。待平板完全冷却后，取0.1mL 链霉素用无菌棒涂布于平板上。其中留三块平板不涂布链霉素作为对照。

3. 诱变处理

(1) 预热正式照射前开启紫外灯预热30 min。

(2) 搅拌取制备好的菌悬液5 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20 W 紫外灯下30 cm 处。

(3) 照射然后打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为5s，10s，15s。可以累积照射，照射完毕先关上皿盖再关闭搅拌和灯。所有操作必须在红灯下进行。

4. 稀释涂平板

在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5mL 进行适当稀释分离。取最后3 个稀释度的稀释液涂于肉膏蛋白胨平板上，每个稀释度涂3 个平板，每个平板加稀释液0.1 mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，37℃培养48 h(用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别。

(二) 计篡存活率及致死率

1. 存活率

将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。

存活率 =处理后1 mL 菌液中活菌数÷对照1 mL 菌液中活菌数

2. 致死率

致死率 =（对照1 mL 菌液中活菌数—处理后1 mL 菌液中活菌数）/对照1 mL 菌液中活菌数

3.突变率

自发突变率＝诱变前样品中Str抗性菌数/诱变前活菌数

突变率＝后培养以后样品中Str抗性菌数/后培养以后样品中的活菌数

同样计算用紫外线处理5s、10s、15s、后的存活细胞数及致死率。

（三）诱变后培养

1.取1mL诱变处理好的菌悬液接入肉膏蛋白胨液体培养基中进行后培养，37℃120rpm摇瓶避光培养；

2.对后培养的菌悬液进行平板菌落计数。

（四）菌株的筛选

1.将经过诱变后培养的菌悬液适当稀释后，分别涂布于含最小抑制浓度的链霉素培养基平板上，37℃培养长出的菌落即为链霉素抗性突变株。

2.计抗性菌落数，计算诱发突变率，观察紫外诱变的效果。

五、实验数据记录与处理

（一）将实验结果按表要求如实填入，并分别算出存活率，致死率。

表1 紫外线处理后枯草芽孢杆菌的存活率及致死率

对照组