热液区管状蠕虫几丁质结合蛋白的克隆表达及功能鉴定

为 ０ １ ｏ ｄ Ｔ ｅｎ２ ． ５ ｔ ｌ ｉ ， ｗ ｅ ０体 积 浓 度 为 ０ １ ， Ｈ ｏ ／ｎ ．％ ｐ 值 为 ７ ５ 的质量 浓 度 为 ５ 的脱脂 牛奶 中 ， 室 温 ．） ％ 于
糖凝胶 电泳后进行胶 回收， 然后将其连接至 ｐ Ｄ ８ Ｍ １一
Ｔ Ｖ ｃｏ 并转化 大 肠杆 菌感 受态 细胞 Ｔ ｐ Ｏ 随机 挑 ｅｔ ｒ ｏｌ．
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ：０ ０８ ６ （ ０ ２ ０ －０ ４０ １０ —１０ ２ １ ） ｌ ３ －５ ０
深海 热液 区 以其 独特 的极端 环境孕 育着 特殊 的
质粒 ｐＺＦ Ａ 由 本 实 验 室 改 造 自 ｐＺ Ｖ 一 ｉ； Ｉ Ｌ Ｇ ｌ／ ５Ｈ ｓ
ｐ ＭＤ１ Ｔ ｃ ｏ Ｐｒｍｅ ｓａ ８一 Ｖｅ ｔｒ、 ｉ ｒｔｒ ＨＳ ＤＮＡ ｌ ｍｅ ａ ｅ、 Ｐｏｙ ｒ ｓ Ｔ４
１ 期
ｍ ｍ
。
，
闫鑫富 ， 阮灵伟 ： 热液 区管 状蠕 虫几丁质结合蛋 白的克隆表达及功能鉴定
。３ ５。
正 、 向 引 物 （ ０ ｉ ｌｄ 。 反 ２ ｘ ／ ｍ ）的 体 积 各 为 １ ｍｏ ｅＮ Ｄ Ａ文库 质粒 Ｄ Ａ为 １０ｎ ， 双蒸 水补 至 Ｎ Ｏ ｇ 用
滤纸 、 海绵 、 正极 的顺序 ， 装 蛋 白转 印装 置 ， １０ 安 在 ０
大的应 用潜 力和应 用价值 ．
关键词： 洋生物 学 ； 海 热液 口； 管状 蠕 虫 ； 丁质结合 蛋 白 ； 隆 ； 几 克 表达
ＤＯＩ １ ． ９ ９ Ｊ Ｉ Ｓ ｔ ０ — １ ０． ０ ２ ０ ． ０ ： ０ ３ ６ ／ ． Ｓ Ｎ． Ｏ ０ ８ ６ ２ １ ． １ ０ ５
中图分类号 ：７５ Ｐ ３
倍 体 积 的 Ｃ Ｉ ｓ ｕｆ 对 结合 混合 物进行 反复 漂 ｏＰｌ ｉ ｂ ｆ ｒ ｙｓ ｅ
司 ； Ｉ Ｇ Ｎ Ｐａｍｉ ＭｉｉＫｔ 自 Ｑ Ａ Ｅ Ｑ Ａ Ｅ ｌｓ ｄ ｄ ｉ ｓ购 Ｉ Ｇ Ｎ公 司 ；
作为这里的生命基础 ， 经过长期 的生物进化形成 了 套独 特 的适 应机 制 ． 前期 工作 中 ， 在 我们 以热液 区
一
的管 状蠕虫 为材 料构 建 了 ｃ Ｎ 文库 ， 过 Ｅ Ｔ测 ＤＡ 通 Ｓ 序 ， 们发 现管状 蠕虫 有编码 几丁 质结合 蛋 白 ， 我 这一 分子 不仅 转录水 平较 高 ， 而且 存在 着多样 性 ， 每种蛋
第３卷 ｌ
第 １期
台
湾
海
峡
Ｆｂ ２ ２ ｅ ． ０１
，
２ １ 年 ２月 ０２
Ｊ ＲＮＡ ＯＣ ＡＮＯＧ ＯＵ Ｌ ＯＦ Ｅ ＲＡＰ Ｉ Ｔ Ｗ Ａ Ｓ ＲＡＩ ＨＹ Ｎ ＡＩ Ｎ Ｔ Ｔ
热 液 区管状 蠕 虫 几 丁质 结 合 蛋 白的 克 隆表 达及 功 能 鉴定
Ｖ恒 定 电压 下 ， ４Ｃ转 膜 １ｈ 将 蛋 白转 印 膜用 溶 于 ￣ ；
于 Ｔ Ｓ （ ｒ — １ 度 为 ０ ０ ｏ ｄ Ｎ Ｃ 浓度 Ｂ Ｔ Ｔ ｉ ＨＣ 浓 ｓ ．５ｔ ｌ ｉ ， ａ１ ｏ ／ｎ
。
ｍ ｍ
，
总体 积为 ５ ｍ ． Ｃ ０ｒ Ｐ Ｒ程 序 如 下 ：８Ｃ变性 ５ｍｉ ； ｎ ９￣ ｎ ９ ℃ 变性 １ ，５ 退火 ３ ，８ 延伸 １ｒｉ， ３ ８ ０ Ｓ５ ０ Ｓ６ ｎ共 ０ ａ 个 循 环 ；８Ｃ 伸 １ ｉ ； 停 止． Ｃ ６ ￣延 ０ｒ ｎ４ ａ Ｐ Ｒ产物 经琼 脂
种 不同 的几丁 质结 合蛋 白 Ｊ鉴 于管 状蠕 虫 几 丁 质 ． 结合 蛋 白的多 样性 及其 可 能 的重要 作 用 ， 们选 择 我 其 中最 具代表 性 的四个 几丁质结 合蛋 白分 别进行 了
分 子克 隆 、 源重组 表达 ， 异 并对 几 丁质 结合 蛋 白的亲 和性质 和辅 酶活性 等进行 了初 步研究 ．
司； 抗体 均购 自 ＳＧ ＩＭＡ公 司 ； 化纤 维素膜 购 自 Ｇ 硝 Ｅ
公司 ； ｐｒ ｉ ａ试剂盒购 自ＰＥ Ｃ Ｓ ｅ Ｓ ｎｌ ｕ ｇ ＩＲ Ｅ公司； 其余试
剂均 为 国产 分析 纯试 剂． １ ２ 几丁质 结合 蛋 白基 因的克隆 ．
根据 四 条 已知 序 列 （ ｅｅ ａｋ序 列 号 分 别 为 Ｇ ｎＢ ｎ
１ ４ 几 丁质 结合蛋 白亲 和性质 分析 ． 分别 称 取 ２ 【 ｈｔ 、 －ｈｔ ， 入 ２ ０ ｃ ５ ｇｏ ｃ ｉｎ ［ｃ ｉｎ 加 一 ｉ ３ ｉ ５ ｍ
体 积 的 ８％ 磷 酸 ， ３ ￣下 反应 １５ｄ然 后加 蒸馏 ５ 于 ０Ｃ ． ．
复 苏 Ｈ５细胞 ， １。 ｅｓ￣ 接 种 至 ６孔 细胞 ｉ 按 ０ ｅｌ／： ｌ Ｌ 培 养板 ， 预 加 １ｃ 。 Ｆ — ｓｃ 无 血 清 培养 基 ， 并 ｍ Ｓ ＸＩ ｅｔ ｎ 于 ２￣ ７Ｃ培养 过 夜． 重 组 表 达 质 粒 ｐＺＦ Ａ —Ｂ 将 Ｉ—Ｌ ＧＣ Ｐ分 别 与 ２０ｍｉ体积 的 培 养基 混 匀 制 备 Ａ 液 ； ２０ ０ ｌ ｌ 取 ０ ｍ 积 的培养基 与 ４Ｉｉ体 积 的 ｃ］ｅｔ 染 试 ｍ体 ｉ ｎｌ ｅ］ｃｎ转 ｆ ｉ 剂混 匀制 备 Ｂ液 ； 将 Ａ、 再 Ｂ两 种 液 体 混 合 制 备 ｃ 液 ， 于 ２ ￣培 养 箱 中预 热 ３ ｉ． 复 苏 培 养 过 置 ７Ｃ ０ｒｎ 将 ａ 夜 的 Ｈ５细胞 中 的培 养 基 去 除 ， 用 培养 基 漂 洗 一 ｉ 并
物 转化 到大 肠杆 菌 感 受 态 细胞 Ｔ ｐ Ｏ中 ， 过 Ｐ Ｒ ｏｌ 通 Ｃ 验证 ， 挑取 阳性 克隆 子进行 测 序验证 ．
１ ３ 几丁质 结合 蛋 白基 因的表 达 与制备 ．
ａ ， ｒｎ 用超 纯 水再 漂洗 两 次 ， 次 １ ｉ； ＰＥ Ｃ ｉ 每 ０ｒｎ 用 ＩＲ Ｅ ａ Ｓｐｒ ｉｎｌ 剂盒对 蛋 白转 印膜 进行 曝光 检测 ． ｕｅ ｇａ试 Ｓ
闫鑫 富 ， 阮灵 伟
（ 国家海洋局第三海洋研究所 、 海洋生物遗传资源重点实验室 ， 福建 厦 门 ３ １０ ） ６０ ５
摘要： 文应 用 Ｐ Ｒ技 术对 四种管状 蠕 虫几 丁质 结合 蛋 白进 行 了扩 增 ， 而连接 到 ｐＺＦ Ａ 本 Ｃ 进 ｌ．Ｌ Ｇ构 建 了重组表 达载体 ， 并在 昆 虫细胞 中实现 了几 丁质结合 蛋 白的异 源重组表 达． 们 对几 丁质结合 蛋 白 我
Ｅ ８２６ Ｅ ８２６ Ｅ ８２７ Ｅ ８２ ８ ） Ｖ ０ ５ ２、Ｖ ０ ５ ７、Ｖ ０ ５ ９、 Ｖ ０ ５ ７ 的开放
阅读 框 ， 信号 肽剪 切后 ， 将 设计 引物 ， 过 Ｐ Ｒ分别 通 Ｃ
１ 材料与方法
１ １ 材 料和试 剂 ．
扩增几 丁质结 合蛋 白基 因 （ ） 反应 体 系为 ５ ｃ ． ０
封 闭 １ｈ 然 后用抗 Ｆ Ａ ； Ｌ Ｇ小 鼠源单 克 隆抗 体 Ａ Ｔ— ＮＩ
Ｆ Ａ 溶 于 ｌ 质量 浓度 的 Ｂ Ａ， 同） 温下 孵育 Ｌ Ｇ（ ％ Ｓ 下 室 ２ｈ 用 Ｔ Ｓ ； Ｂ Ｔ漂 洗两 次 ， 次 １ ｉ ； 用 羊 抗 小 鼠 每 ０ｒ ｎ 再 ａ
选 １ 克 隆 子 进 行 Ｐ Ｒ实 验 ， 证 其 片 段 插 入 情 ０个 Ｃ 验
收稿 日期 ：０ １）—６ ２ １ ４３１
体积为 ｌ ｉ ， Ｐｉｅ ｔ ｕ ｅ（ Ｍ ）的体 ｌ ５× ｒ ｒ ａ Ｂ ｆｒ含 ｇ ｍｌ ｍ ｓｒ ｆ 积 为 １ ｍ ， Ｎ Ｐ（ ． ｏ ｄ ０ ｍ ｄ Ｔ ２ ５ ｍｍ ］ ｍ ）的 体 积 为 ４ ／
基金项 目： 国际海底区域研究开发“ 十一五” 课题资助项 目（ Ｙ Ｄ ＸＭ—１－２２１ ） ｌ５０ －－６ 作者简介 ： 闫鑫富（ ９ ５～） 男 ， １８ ， 硕士研究生 ； — ｉ： ｍ ｘａｂｏ ｍａ ．Ｏ￣ Ｅｍａ ｘ ｕｉ ａ＠ｇ ｉ ＣＩ ｌ ｏ ｌ Ｉ － 通讯作者 ： 阮灵伟 （９ １ ， １８ ～） 博士 ， 助理研究员 ； — ｉ： ｕｎｉｇ ｅ＠ｙｈｏ ＣＢ．ｎ Ｅｍａ ｒａ ｌ ｗ ｉ ａｏ．Ｏ ｃ ｌ ｎ
高效感受态细胞制备试剂盒 ， 自鹭隆生物有 限公 购
司 ； 丁质 酶 Ｂ Ｈ １购 自 Ｎ ｗ Ｅ ｇａｄ Ｂｏ ｂ 公 几 ｍＣபைடு நூலகம்Ｔ ｅ ｎｌ ｉａｓ ｎ ｌ
白都带有 １ ３个不同类 型的几 丁质结合区（ ｈｉ ～ ｃｉ ｔ ｎ ｂｎ ｉｇｄ ｍ ｉ， Ｂ ， ｉｄｎ ｏ ａ Ｃ Ｄ） 由不 同 的 Ｃ Ｄ共 组 成 了 ２ ｎ Ｂ ３
的功能进行 了初步研究， 亲和活性实验结果表明这四种几丁质结合蛋 白对 ｏｃｉ Ｌｈｉ ． ｔ ｎ具有亲和活性， 并且 可 以辅助 几丁质 酶 ， 降解 Ｏｃｉｎ和 Ｂｃｉｎ均有 不 同程 度 的促进 作用 ， 对 ｔ ｈｔ — ｉ ．ｈｔ ｉ 且作 用效果 明显 ． 结
果表 明 ， 四种 几丁质 结合蛋 白均 为 Ｏ型 ， 可 以促 进 几 丁质酶 的 活性 ， 降 解几 丁质 多糖 具 有 巨 这 ｔ 且 对
抗生 素 Ｚｏｉ、ｅｆ ｔ ｅｅｎｃｌｅ ｉ 染试 剂 为 Ｉｖｒｇｎ公 司 ｌｃｎ转 ｎｉｏｅ ｔ 产 品 ；Ｆ ． ｓｃ无 血 清 培 养 基 购 自 Ｈ ｃｏｅ公 司 ； Ｓ Ｘ Ｉ ｅｔ ｎ ｙｌ ｎ 蛋 白胨 、 母膏 、 酵 琼脂 为 Ｂ Ｉ 司产 品 ； Ｎ 片段 胶 Ｂ公 ＤＡ 回收试剂 盒 ， 小量 提取 质粒试 剂 盒 ， 自 Ｏ Ｇ 购 ＭＥ Ａ公
况 ． 选 阳性 克隆子 提取 质粒 ， 含 有 ｃｐ的质 粒 用 挑 将 ｂ
辣根 过 氧化 物 酶标 记 抗 体 Ｇ Ｍ Ｈ Ｐ 溶 于 １ ＆ Ｒ （ ％
Ｂ Ａ） 温孵育 １ｈ 再 次用 Ｔ Ｓ 洗 三次 ， Ｓ 室 ； Ｂ Ｔ漂 每次 １ ０
相 应 的 限 制 性 内 切 酶 进 行 酶 切 ， 时 将 质 粒 ｐＺ 同 ｌ— Ｆ Ａ ｅｔ 也用 相 同 的酶 进行 酶 切 ， 回收 ｃ 片 Ｌ ＧＶ ｃ ｒ ｏ 胶 段 与 载体 片段 ． 将两 者连 接过 夜 （２～１ ） 连接 产 １ ６ｈ ．
ｍ Ｐｉ ｅｓ ｒ ＳＤ Ａ Ｐ ｌ ｒｓ （ ． ／ ｍ ）的 ｍ ：ｒ ｒ ａ Ｎ ｏｙ ａｅ ２ ５Ｕ ｒ ｍ ｔ Ｈ ｍｅ ａ
感受态细胞 Ｅ ｃｌＴｐＯ由本 实验室制备 ； ．ｏ ｏ ｌ ｉ 粉
纹夜 蛾 （ ｒｈｐｕｉ ｉＨｉ 胞 由本 实 验 室 保 存 ； Ｔｉ ｏｌ ａｎ） ５细 ｃ ｓ
次 ； Ｃ液 中加 入 ４ ０ｍｉ 体 积 的培 养 基 ， 匀 ， 在 ０ ｌ ｌ 混 然 后加 人到 细胞 培养 板 中 ； ２ ￣ 培养 ５ｈ 然 后 更 于 ７Ｃ下 ，
水使胶体沉淀 ， 离心 收集几丁质胶体沉淀并 反复水 洗直 至 中性 ． ２ ｔ ｌｄ Ｎ Ｈ２ Ｏ 一 ａＨＰ ４ 用 ０ ｒｏ ／ ｉ ａ Ｐ ４Ｎ ２ Ｏ 缓 ｅ ｏ ｎ
冲液 （ Ｈ值 为 ６ ０ 调 整胶 体 几 丁质 的质量 浓 度 至 ｐ ．）
２％ Ｅ］ ４
．
根据“． ” １３节 的方法 制备 四种 几丁质 结 合蛋 白 重组 表 达 样 品 ， 行 几 丁 质 结 合 蛋 白亲 和 性 质 分 进 析 ． 制备 的蛋 白样 品与 等 量 Ｏｃｉｎ或 Ｂｃｉ 将 Ｌ ｈｔ — ｉ —ｈ— ｔ ｉ 匀 ， ４Ｃ下结 合 ４ｈ 离 心弃 除上 清 ， ｎ混 于 ￣ ； 加入 １０ ０
生物群落 ， 是值得研究与开发的重要生物资源宝库．
热 液 口管状 蠕 虫 是 热 液 生 命 的典 型代 表 ¨ 也 是 。， 目前 阐述热液 生命 形 式 较 为彻 底 的 一种 生 物． 虫 蠕
Ｄ Ａ Ｌｇｓ 、 Ｎ ｉ ｅ 限制性 内切 酶 均 为 Ｔ Ｋ Ｒ ａ ａ ａ ａ公 司产 品 ；