常用染色方法

常用染色方法
过氧化酶染色法(POX) (2)
铁染色法 (2)
碱性磷酸酶染色法(NAP) (3)
糖原染色法(PAS) (4)
非特异性酯酶染色法 (5)
酸性磷酸酶染色法(ACP) (5)
苏丹黑B染色法 (6)
阿利新染色法 (6)
中性粒细胞中毒颗粒染色法 (7)
嗜碱性粒细胞染色法 (7)
嗜酸性粒细胞染色法 (7)
血红蛋白H包涵体染色法 (7)
T和B淋巴细胞酯酶标记鉴别法 (7)
抗酒石酸酸性磷酸酶染色法(偶氮法) (7)
碘化钾过氧化酶染色法(pereira氏法) (7)
5-核苷酸酶染色法 (7)
过氧化酶染色法(POX)
一、溶液配制
第一液 联苯胺 0.3g 待溶解后加入36%亚硝基铁氰化钠1ml （3.6g+6.4ml ） 碱性复红 0.3g 95%酒精 100ml 第二液
3%H 2O 2 0.3ml （7滴） 用时新鲜配制
蒸馏水
25ml
二、操作步骤
1、新鲜涂片加第一液 1分钟
2、再加等量第二液 4分钟
3、用蒸馏水冲洗后，再用95%酒精褪色，至红色褪掉为止
4、水洗后待干，再用瑞氏染液复染，时间为40-50分钟
5、水洗后待干，镜检
三、结果判定
若细胞具有POX ，用此染色即有黑色颗粒出现在细胞内，为阳性，无黑色颗粒为阴性。

1、 粒细胞除早期原粒均为阴性
2、 单核细胞为弱阳性反应，部分网状细胞呈弱阳性反应
3、 淋巴细胞、巨核细胞、浆细胞为阴性反应
铁染色法
一、原理：幼红细胞胞浆内的铁，网状细胞及造血岛内铁粒在酸性条件下，可与亚铁氰化钾起反应，产生蓝色普鲁士蓝沉积。

二、试剂配制
1、20%亚铁氰化钾溶液
2、36%浓盐酸
3、甲醇
4、0.2%核固红（配制：硫酸铝10g 溶于蒸馏水100ml 中，待溶解后加入核固红0.2g 混匀，并放在37℃水浴箱内1小时，时时振荡使其充分溶解后过滤使用） 三、操作步骤
1、新鲜涂片甲醇固定10分钟，蒸馏水洗后晾干
2、(5份20%亚铁氰化钾，1份36%浓盐酸混合成清亮液)染色30分钟，蒸馏水洗后晾干
3、0.2%核固红复染20-30分钟，流水冲洗，晾干。

四、结果判断
外铁：检查展开骨髓小粒，按以下标准记录
阴性（-）：未见铁颗粒
阳性（+）：少数铁颗粒或少数铁小珠 阳性（2+）：较多的铁颗粒及铁小珠 强阳性（3+）：很多铁小珠及少数铁块 强阳性（4+）：很多铁小珠及铁块
细胞内铁：各型铁粒幼红细胞判定标准
Ⅰ型：含铁颗粒1-2颗 Ⅱ型：含铁颗粒3-5颗
Ⅲ型：含铁颗粒6-10颗，或1-4个粗大颗粒
Ⅳ型：含铁颗粒10颗以上，或5个以上粗大颗粒
环形铁粒幼细胞：含铁颗粒6颗以上，其中2/3的铁粒围绕于核周围排列呈环状。

碱性磷酸酶染色法(NAP)
原理：当细胞存在碱性磷酸酶活力时，在碱性的环境下，可将基质物质中的β-甘油磷酸钠水解产生PO 4，进而与钙结合，产生一种不溶解的磷酸钙，再与硝酸钴起作用而成磷酸钴，最终与硫化铵起反应而形成黑色的沉淀于细胞浆中 一、试剂配制
固定液和基质液配前均可在冰箱保存三月左右 二、方法
1、涂片+固定液在4℃以下固定2分钟，蒸馏水冲洗
2、加入基质液放在37℃水浴中3小时（50℃以下），超过37℃时间可缩短，取出后用蒸馏水冲洗
3、浸入2%硝酸钴液中5分钟，蒸馏水冲洗
4、用新鲜配制的1/80硫化铵溶液作用作用10秒钟后用小水冲洗，待干
5、用甲绿复染20分钟 三、结果
1、中性粒细胞胞浆内少数的小黑色颗粒 +
2、中性粒细胞胞浆内较多的棕黑色颗粒 2+
3、中性粒细胞胞浆内均匀分布黑色颗粒 3+
4、中性粒细胞整个胞浆内充满黑色颗粒 4+
根据以上加号数，+记为1分，依此类推，最高为4分，中性粒细胞所有分数加起来，为该病人的积分，胞浆呈淡红色（用0.5-1%伊红复染时），无灰色为阴性。

正常值：血中成熟中性粒细胞：阳性率53.7%，积分81.9±6.4 骨髓成熟中性粒细胞：阳性率49.2% 积分84.9±9.8 临床意义:
1、固定液 甲醛 10ml 混合
甲醇 90ml 2、基质液 10%巴比妥钠
6ml 左述液体混合后以0.2W 氢氧化钠纠正PH9.4-9.8，一般每100ml 基质液中加0.15-0.2ml 氢氧化钠 3.2%β-甘油磷酸钠 6ml 2%硝酸钙（或氯化钙） 9ml
2%硫酸铝 3ml
蒸馏水
33ml 3、2%硝酸钴溶液
4、1/80硫化铵溶液 0.5ml 硫化铵+40ml 蒸馏水
5、1%甲绿溶液
成熟中性粒细胞的碱性磷酸酶活性明显增高，见感染、出血、类白血病反应、真性红细胞增多症、骨髓硬化症，急淋、多发性骨髓瘤、再障等，在急性和慢性粒细胞白血病、病毒感染、PNH时，碱性磷酸酶活性显著降低，急单的酶活性亦低，因此，中性粒细胞碱性磷酸酶反应，有助于粒细胞性的白血病与类白血病反应的鉴别，有助于病毒感染和细菌感染的鉴别。

糖原染色法(PAS)
一、原理：过碘酸时一种氧化剂，它能打断各种物质内的C-C链，当乙二醇基（CHOH-CHOH）存在时，能使其变为二醛（CHO-CHO），醛再被进一步氧化而与雪夫氏试剂中的无色复红结合成红色的化合物，红色反应的深浅有赖于组织内α-醇基的多少。

除糖原能与过碘酸反应的还有粘蛋白、粘多糖、糖蛋白、糖脂类、不饱和脂肪酸类和磷脂。

但糖原能被唾液淀粉酶消化，其它阳性物质不被消化，故将经过唾液处理后的涂片，再经PAS染色可以鉴别之。

二、试剂
1、1%过碘酸（新鲜配制）：过碘酸0.5g+蒸馏水50ml
2、雪夫氏试剂
配制方法1：碱性品红2.6g（0.33g）放置于已加热60℃416ml（52ml）蒸馏水中使其全部溶解，偏重亚硫酸钠或重亚硫酸钾16g（2g），1N的HCL80ml（10ml），静置片刻后加活性炭4g（2g），振荡2-3分钟过滤后无色即可用。

如仍有红色，再加适量活性炭。

（1N盐酸配制：8.6ml浓盐酸加蒸馏水至100ml）
方法2：
1）碱性复红：1g
2）当量盐酸：20ml（浓盐酸2ml）
3）无水亚硫酸钠：1g
4）活性炭：2g
5）蒸馏水：200ml
将蒸馏水煮沸后加入复红，冷至50℃时加入当量盐酸，再冷至25℃加入亚硫酸钠，摇匀将瓶盖塞紧，置于暗处，24小时后加入活性炭。

振荡后过滤使用，盛于有色瓶中密封冷藏，可保存数月。

3、1%甲基绿：2g+蒸馏水200ml，充分溶解后放入分液漏斗中以每次少许氯仿，以除去甲基紫至氯仿无色为止。

三、操作
1、血片或骨髓片在空气中干燥后，用甲醇固定5分钟（或95%乙醇）
2、过碘酸作用10分钟
3、水洗5-10分钟
4、雪夫氏试剂作用30分钟（置暗处）
5、水洗5-10分钟
6、甲基绿复染30分钟
7、水洗待干镜检
四、结果
细胞核无色，浆与颗粒部分呈红色，复红颗粒色深浅及颗粒多少而决定积分。

细胞浆内无染色颗粒为0分
细胞浆内微红颗粒染色不显著或1-10颗粒，为1分或（+）
细胞浆内染浅红色，有少数染红色颗粒或10-20颗，为2分或（2+）
细胞浆内染深红色，有的成较粗的块状或20-30颗，为3分或（3+）
细胞浆内染深红色块状，颗粒在30个以上充满胞浆，为4分或（4+）
非特异性酯酶染色法
一、原理：α-乙酸茶酚酯酶将乙酸茶酚水解，再与重氮盐（如坚牢蓝B）偶联，生成不溶性的有色（灰色或棕黑色）沉淀
二、试剂配制
1、10%甲醛生理盐水
2、基质液制备
（1）0.05M磷酸盐缓冲液40ml
M/15 Na2HPO4Na2HPO4 5.97g
80ml 蒸馏水250ml
M/15 KH2PO4KH2PO4 2.268g
20ml 蒸馏水250ml
（2）重氮盐（可用固兰盐代替）40mg
（3）1%α-乙酸茶酚酯（用50%丙酮作溶剂）0.8ml
以上试剂混合后放入骨髓片或血片
三、操作步骤
1、新鲜涂片用10%甲醛生理盐水固定5分钟
2、蒸馏水洗后放入基质液中37℃孵育1小时
3、取出后用水冲洗后用甲基绿复染(不染色也可以)15分钟
4、水洗，干后镜检
四、结果判断
阳性时为絮状沉淀于胞浆中
灰黑色±
棕黑色+
深黑色2+
五、临床意义
1、原始单核细胞呈阳性反应，原始较晚及幼单以下呈阳性反应，随细胞成熟而增强。

2、血小板、巨核细胞浆内可出现阳性反应，其它血液成分均为阴性
注：氟化钠抑制试验：上述孵育液加入氟化钠60mg孵育1小时
酸性磷酸酶染色法(ACP)
酸性磷酸盐（ACP）染色分硫化铝染色法和偶氮偶联法，下面是硫化铝染色法。

一、原理
酸性磷酸酶在酸性条件下，能将甘油酸钠水解产生PO4-,进而与pb作用生成磷酸铅沉淀，附着于酶活性存在之处，再与硫化铵作用，生成黑色硫酸铅。

二、试剂
苏丹黑B染色法阿利新染色法
中性粒细胞中毒颗粒染色法
嗜碱性粒细胞染色法
嗜酸性粒细胞染色法
血红蛋白H包涵体染色法
T和B淋巴细胞酯酶标记鉴别法
抗酒石酸酸性磷酸酶染色法(偶氮法) 碘化钾过氧化酶染色法(pereira氏法) 5-核苷酸酶染色法。