荧光显微技术在细胞生物学中的应用
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荧光显微技术在细胞生物学 中的应用
一.序言 二.生物细胞中汞离子的探测。 三.学习总结
一. 序言
1．1研究背景 随着生物研究的发展，对于超高分辨与高 信噪比成像技术的要求越来越高。近年来，共 焦荧光显微术和全内反射荧光显微术显示了很 好的发展前景。这两项光学成像技术在分子生 物学、分子化学及纳米材料等领域受到了广泛 关注。 激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope LSCM)是上世纪80年代 开始投入实际应用的一种荧光显微设备。与普 通光学显微镜相比，LSCM具有更高的分辨率和 放大倍率，并可以对样品进行分层扫描，实现 三维重建和测量分析；与电子显微镜相比， LSCM可以在亚细胞水平上观察诸如ca2+和膜电 位等生理信号及活细胞形态的实时动态变化。
2．2汞离子的荧光探测方法
近年来还是有很多关于荧光探针的报道。在这些荧光探针中，大部分是 通过探针与汞耦合后荧光强度的变化来探测汞．由于其荧光很弱，所以在复 杂环境中，一旦探针分布不均匀，就很难通过荧光强度的变化进行准确的检 测。另外。由于它们中的大部分只能在有机溶剂中探测，很少有可以在水环 境下检测的探针。所以，这些探针很难用于检测生物体中的汞污染。再次， 由于其本身技术的限制，探测灵敏度都不是很高，约在10-4 M附近。因此，寻 求一种可以在生物中探测微量汞离子的荧光探针成为了首要目标。
Biblioteka BaiduⅡ.利用激光扫描共焦显微成像与激光微区光谱分析技术，我们首次成功
地将一种新的汞离子探针运用于对活体细胞中微量汞离子的检测。当探针与 汞离子反应以后，它的光谱会产生大约50nm左右的蓝移，因此可以在很大程 度上避免由复杂的生物环境带来的浓度分布不均匀所产生的测量上的影响。
同时它具有很高的双光子吸收截面。在双光子激发下用于生物探测有很 多优越性，能够屏蔽很多其他物质的干扰，具有较大的穿透深度和较小 的细胞伤害等。
(3)用氮烯丙基取代原来的氮丁基，使得BNPTU比原来的荧光探针具有更
好的溶解度。BNPTU在乙腈中的溶解度是9x10-4 M，在水和乙腈的混合溶液(v ／v=l／9)中的溶解度是5×10-5M，而原来化合物的溶解度只有现在的10％。 同时，BNPTU在水中的溶解速度也大大的得到了提高，使得它更适用于生物环 境中的应用。 (4)灵敏度比其他同类探针有大大提高，可以探测到ppb的水平。 (5)具有很高的离子选择性。 (6)具有很小的生物毒性。 在本文中，为了书写方便，将BNPTU定义为l，当它与汞离子发生反应 后，其结构我们把它定义为2。我们将在下面章节中详细讨论l和2的一些特性 以及他们在生物细胞内的应用。
的细胞中的探针荧光光谱，曲线2表示用1(1×107M)和Hg2+(2×10-6M)孵化的细胞中的探针荧光光 谱，曲线3是细胞的自体荧光光谱。
我们可以从图3．3(A)中看到，1和2发出的荧光只比其自体荧光大5倍左右。也就 是说，如果我们继续降低1或者在细胞内的浓度，那么它所发出的荧光就会被生物体 的自体荧光所干扰，这就是单光子激发所带来的局限性。反观双光子荧光(图 3．3(B))，对于只吞噬了l(1x10-7 M)的细胞，其荧光光谱的峰值在538士3 nm；而同 时吞噬了1(1x10-7M)和Hg2+(2x10-6M)的细胞，其荧光光谱的峰值在503士2 nm。两者 的荧光会有大约35m的蓝移，与单光子激发类似。但是，从图中可以很清晰的看到， 双光子激发的探针荧光比自体荧光大15倍左右。也就是说,如果用双光子激发可以大 大提高信噪比，对探测生物体中的汞是非常有利的。 因此可见，如果探针具有较大的双光子吸收截面，那么它将会在复杂的生物环 境中有着更广阔的应用。 3．4结论 我们首次成功地将一种新的汞离子探针BNPTU，运用于对活体细胞中微量汞离 子的检测。在检测汞离子的时候，BNPTU显示的是光谱变化，这可以在很大程度上避 免由于复杂的生物环境带来的浓度分布不均匀所产生的测量上的影响。同时它具有 很高的双光子吸收截面，双光子激发对于生物探测有很多优越性，能够屏蔽很多其 他物质的干扰，具有较大的穿透深度和较小的细胞伤害等。这个探针还有很好的溶 解度和溶解速度。使得其更适用于生物环境中的应用。
二.微量汞离子的探测
2.1微量汞离子的探测. 环境中任何形式的汞均可在一定条件下转化为剧毒的甲基汞。据 《全球汞状况评估》的报告中指出人类受汞污染伤害的途径有很多， 但大多数人是因为食用了被汞污染的鱼类和海洋哺乳动物。 因而环境水样以及生物体中的汞含量测定具有重要意义。目前用 于汞的测定方法主要有：原子吸收光谱，x射线分析以及”Hg2+检测 等。这些测量方法虽然都能到达到比较高的灵敏度，但是往往需要昂 贵的设备以及大量的样品。而且其测量是以损害生物体为基础的，根 本没有办法做到活体检测。因此，寻求新的汞探测方法是一个持续的 热门方向。
因为我们需要培育细胞进行汞离子的吞噬。所以取适量裸藻细胞悬浮培养液， 在室温下离心3 min(2000 r／min)，洗涤3次去除培养物质。令纯净的细胞沉降物
与适量去离子水混合，然后再注入事先设计好浓(CH3CO2)Hg溶液。将样品放在先前 的培养环境下,让细胞吞噬汞离子24小时。另外取一批干净的细胞同时培养，以作 对比。 将裸藻细胞和含有(CH3CO2)Hg的悬浮液，在室温下离心3 min(2000 r／min)， 用PBS洗涤3次来去除溶液中的杂质和残余的汞离子。然后再将洗好的吞噬了汞离子 的细胞和作对比的细胞分别放在预先设计好浓度的BNPTU的溶液中在室温下培育 0．5小时。最终离心3 min(2000 r／min)，用PBS洗涤3次来去除溶液中BNPTU。这 样，细胞就可以用来做荧光成像和光谱分析的测试了。 我们的最终目标就是利用荧光探针来探测生物细胞中的微量汞离子。因此探 针的低毒性显得尤为重要。通过显微镜观察，吞噬了BNPTU的裸藻细胞三天后仍然 没有显示出任何形态上的损坏以及中毒症状，细胞仍然和正常的一样在水中活动性 很高，说明探针完全符合生物应用的要求。
四.学习心得
Ⅰ.随着生物研究的发展，对于超高分辨率的成像与高信噪比成像技术的要 求越来越高。近些年来，共焦荧光显微术和全内反射荧光显微术显示了很好 的发展前景。这两项光学成像技术在分子生物学、分子化学及纳米材料等领 域受到了广泛关注。激光扫描共焦显微镜由于其高分辨率、高灵敏度、高放 大率等特点，在细胞水平上可作多种功能测量和分析，成为分析细胞学的一 项重要研究手段。而全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生 物光学显微技术之一，可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。
二.生物细胞中汞离子的探测
在这一主题中，着重研究了BNPTU在生物细胞中的应用。 探讨了生物细胞的选择以及培育方法，详细研究了探针在 细胞内的状态，分析了探针在细胞被汞离子污染前后的荧 光光谱。
3．1生物细胞的选择和培育 单细胞的纤细裸藻(Euglena gracilis 277)被我们选做模型进行活体 探测。纤细裸藻是淡水性微小单细胞真核生物，在植物学上归为裸藻 门，动物学上归为原生动物门，因此它同时具有动物和植物的特性。 同时，它还有很强的吞噬外界物质的能力。纤细裸藻被大量的用于毒 性和环境测试。并且被认为是在环境污染尤其是工业污染的生物测试 中的一种标准生物指示剂。
1．1．1共焦荧光显微术
1．1．2全内反射荧光显微术 细胞内含有多种分子机器，涉及细胞运动、DNA转录加工、细胞信号转导、 蛋白质合成和蛋白质折叠等多种过程，这些分子机器在活细胞中协调运作， 使细胞功能得到发挥。传统的分子和细胞生物学技术已经比较深入地阐明了 分子机器中生物分子的构成及其所扮演的角色，但是单个分子的活动却被平 均化而观察不到。迄今为止，在细胞生物学领域所进行的研究，绝大部分是 集合平均(ensemble averaging)效应，而不是单分子研究。 荧光单分子检测技术(single molecule detection)是用荧光标记来显示和追 踪单个分子的方法。由于荧光信号测量灵敏度高以及光子对分子干扰最轻微， 全内反射技术被广泛应用于单分子研究．尤其对于需观察细胞内单分子实时 变化的细胞生物学研究。全内反射被认为是非常有效的技术。全内反射荧光 显微术成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途 的光学成像技术。现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆 球蛋白分子的运动、单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移、ATP酶的翻转， 聚合物内单个分子的结构变化以及等离子体膜附近的神经分泌腺的颗粒运动 等多方面。
通过激光扫描共焦显微镜，我们 首先观察吞噬了1和Hg2+的细胞的荧光 图像。因为1和2的荧光光谱峰值分别 在550 nm和495nm附近，所以我们选用 505—550nm的滤色片来滤去激发光和 680nm左右的叶绿素的荧光。通过光谱 分析(见图3．3)可知，细胞内的荧光 分布主要是2产生的(可能含有少量未 反应的1)，2在细胞内的三维分布如图 3．2(A)所示，其中主图展示的是细胞 内X-Y平面的荧光分布，主图右侧和下 面显示的则是X-Z与Y-Z的剖面图。我 们可以看到2在细胞中的分布是比较均 匀的。同时我们测量了细胞的DIC (differential interference contrast)图像，来观察其形态．图 3．2(C)则是(A)和(B)的合并。通过观 察荧光像可以确实证明细胞吞噬了探 针和Hg2+。我们同时观察了用来做对比 的只吞噬了1的细胞，得到了相似的荧 光像。
得到的的荧光探针BNTPU比传统的荧光探针 有着明显的优势：
(1)相对于大部分探针显示的荧光强度变化而言，BNTPU最大的特点就
是在探测汞离子的时候显示的是光谱位移。由于汞离子的嗜硫性，可以使原 来的硫脲基团转变成半族咪唑，这样就会缺失很多电子授予基团，因此会带 来大量的荧光团的电子失位的损耗，从而使得BNTPU探测汞离子的时候显示出 显著的光谱蓝移。这样可以排除溶液浓度变化对荧光强度的影响，在很大程 度上避免了由于复杂生物环境所带来的浓度分布不均匀引起的测量误差. (2)BNPTU具有很高的双光子吸收截面。由于双光子在生物探测中有着重要 的应用，双光子吸收性质在最近得到极大的重视。双光子过程在生物应用中 有着许多优点：它穿透性强：可以得到很好的空间分辨；红外光激发可以减 少生物损伤：可以有效的避开生物体的自体荧光等等。
2．3汞离子荧光探针BNPTU
本实验中使用的汞离子荧光探针是由华东理工大学化学系合成的。他们
对原先合成的汞离子荧光探针进行改进，取得了具有较高的溶解度和溶解速 率以及较大的双光子吸收截面的新型探针。荧光探针的合成过程以及与汞反 应生成的产物如图2．1所示。
2．3汞离子荧光探针BNPTU
图2．1 BNPTU的合成过程以及与汞离子反应以后结构的变化。
图3．2(A)细胞内2的荧光图像。主要的那副 图像展示的是细胞内X．Y平面的分布，右侧 和下面的 则是X．Z与Y的剖面 (B)DIC图像 (c)图像A 和B的合并
3．3单光子激发和双光子激发的比较。 研究可知，l和2的双光子吸收截 面分别为4．1士0．4和13．4士1．8， 而riboflavin和FAD的双光子吸收截 面分别为1．23和0．035，探针的双 光子吸收截面远大于细胞内主要荧光 物质黄素的双光子吸收截面。因此， 使用双光子激发，必定可以得到更好 的信噪比，从而来提高探测的灵敏度。 为此我们将探针的单光子、双光子光 谱和细胞自体荧光的光谱进行了对比， 我们通过前面得到的细胞荧光像。选 择某一微区测量得到的荧光光谱如图 3．3所示。其中。曲线1表示未经汞 离子孵化的细胞中的1的光谱，曲线2 表示用汞离子孵化后的细胞中的2的 图3．3细胞中探针的单光子激发(A)和双光子激发 光谱，曲线3为细胞的自体荧光光谱。 (B)的荧光光谱。其中曲线1表示1(1×10-7M)孵化
一.序言 二.生物细胞中汞离子的探测。 三.学习总结
一. 序言
1．1研究背景 随着生物研究的发展，对于超高分辨与高 信噪比成像技术的要求越来越高。近年来，共 焦荧光显微术和全内反射荧光显微术显示了很 好的发展前景。这两项光学成像技术在分子生 物学、分子化学及纳米材料等领域受到了广泛 关注。 激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope LSCM)是上世纪80年代 开始投入实际应用的一种荧光显微设备。与普 通光学显微镜相比，LSCM具有更高的分辨率和 放大倍率，并可以对样品进行分层扫描，实现 三维重建和测量分析；与电子显微镜相比， LSCM可以在亚细胞水平上观察诸如ca2+和膜电 位等生理信号及活细胞形态的实时动态变化。
2．2汞离子的荧光探测方法
近年来还是有很多关于荧光探针的报道。在这些荧光探针中，大部分是 通过探针与汞耦合后荧光强度的变化来探测汞．由于其荧光很弱，所以在复 杂环境中，一旦探针分布不均匀，就很难通过荧光强度的变化进行准确的检 测。另外。由于它们中的大部分只能在有机溶剂中探测，很少有可以在水环 境下检测的探针。所以，这些探针很难用于检测生物体中的汞污染。再次， 由于其本身技术的限制，探测灵敏度都不是很高，约在10-4 M附近。因此，寻 求一种可以在生物中探测微量汞离子的荧光探针成为了首要目标。
Biblioteka BaiduⅡ.利用激光扫描共焦显微成像与激光微区光谱分析技术，我们首次成功
地将一种新的汞离子探针运用于对活体细胞中微量汞离子的检测。当探针与 汞离子反应以后，它的光谱会产生大约50nm左右的蓝移，因此可以在很大程 度上避免由复杂的生物环境带来的浓度分布不均匀所产生的测量上的影响。
同时它具有很高的双光子吸收截面。在双光子激发下用于生物探测有很 多优越性，能够屏蔽很多其他物质的干扰，具有较大的穿透深度和较小 的细胞伤害等。
(3)用氮烯丙基取代原来的氮丁基，使得BNPTU比原来的荧光探针具有更
好的溶解度。BNPTU在乙腈中的溶解度是9x10-4 M，在水和乙腈的混合溶液(v ／v=l／9)中的溶解度是5×10-5M，而原来化合物的溶解度只有现在的10％。 同时，BNPTU在水中的溶解速度也大大的得到了提高，使得它更适用于生物环 境中的应用。 (4)灵敏度比其他同类探针有大大提高，可以探测到ppb的水平。 (5)具有很高的离子选择性。 (6)具有很小的生物毒性。 在本文中，为了书写方便，将BNPTU定义为l，当它与汞离子发生反应 后，其结构我们把它定义为2。我们将在下面章节中详细讨论l和2的一些特性 以及他们在生物细胞内的应用。
的细胞中的探针荧光光谱，曲线2表示用1(1×107M)和Hg2+(2×10-6M)孵化的细胞中的探针荧光光 谱，曲线3是细胞的自体荧光光谱。
我们可以从图3．3(A)中看到，1和2发出的荧光只比其自体荧光大5倍左右。也就 是说，如果我们继续降低1或者在细胞内的浓度，那么它所发出的荧光就会被生物体 的自体荧光所干扰，这就是单光子激发所带来的局限性。反观双光子荧光(图 3．3(B))，对于只吞噬了l(1x10-7 M)的细胞，其荧光光谱的峰值在538士3 nm；而同 时吞噬了1(1x10-7M)和Hg2+(2x10-6M)的细胞，其荧光光谱的峰值在503士2 nm。两者 的荧光会有大约35m的蓝移，与单光子激发类似。但是，从图中可以很清晰的看到， 双光子激发的探针荧光比自体荧光大15倍左右。也就是说,如果用双光子激发可以大 大提高信噪比，对探测生物体中的汞是非常有利的。 因此可见，如果探针具有较大的双光子吸收截面，那么它将会在复杂的生物环 境中有着更广阔的应用。 3．4结论 我们首次成功地将一种新的汞离子探针BNPTU，运用于对活体细胞中微量汞离 子的检测。在检测汞离子的时候，BNPTU显示的是光谱变化，这可以在很大程度上避 免由于复杂的生物环境带来的浓度分布不均匀所产生的测量上的影响。同时它具有 很高的双光子吸收截面，双光子激发对于生物探测有很多优越性，能够屏蔽很多其 他物质的干扰，具有较大的穿透深度和较小的细胞伤害等。这个探针还有很好的溶 解度和溶解速度。使得其更适用于生物环境中的应用。
二.微量汞离子的探测
2.1微量汞离子的探测. 环境中任何形式的汞均可在一定条件下转化为剧毒的甲基汞。据 《全球汞状况评估》的报告中指出人类受汞污染伤害的途径有很多， 但大多数人是因为食用了被汞污染的鱼类和海洋哺乳动物。 因而环境水样以及生物体中的汞含量测定具有重要意义。目前用 于汞的测定方法主要有：原子吸收光谱，x射线分析以及”Hg2+检测 等。这些测量方法虽然都能到达到比较高的灵敏度，但是往往需要昂 贵的设备以及大量的样品。而且其测量是以损害生物体为基础的，根 本没有办法做到活体检测。因此，寻求新的汞探测方法是一个持续的 热门方向。
因为我们需要培育细胞进行汞离子的吞噬。所以取适量裸藻细胞悬浮培养液， 在室温下离心3 min(2000 r／min)，洗涤3次去除培养物质。令纯净的细胞沉降物
与适量去离子水混合，然后再注入事先设计好浓(CH3CO2)Hg溶液。将样品放在先前 的培养环境下,让细胞吞噬汞离子24小时。另外取一批干净的细胞同时培养，以作 对比。 将裸藻细胞和含有(CH3CO2)Hg的悬浮液，在室温下离心3 min(2000 r／min)， 用PBS洗涤3次来去除溶液中的杂质和残余的汞离子。然后再将洗好的吞噬了汞离子 的细胞和作对比的细胞分别放在预先设计好浓度的BNPTU的溶液中在室温下培育 0．5小时。最终离心3 min(2000 r／min)，用PBS洗涤3次来去除溶液中BNPTU。这 样，细胞就可以用来做荧光成像和光谱分析的测试了。 我们的最终目标就是利用荧光探针来探测生物细胞中的微量汞离子。因此探 针的低毒性显得尤为重要。通过显微镜观察，吞噬了BNPTU的裸藻细胞三天后仍然 没有显示出任何形态上的损坏以及中毒症状，细胞仍然和正常的一样在水中活动性 很高，说明探针完全符合生物应用的要求。
四.学习心得
Ⅰ.随着生物研究的发展，对于超高分辨率的成像与高信噪比成像技术的要 求越来越高。近些年来，共焦荧光显微术和全内反射荧光显微术显示了很好 的发展前景。这两项光学成像技术在分子生物学、分子化学及纳米材料等领 域受到了广泛关注。激光扫描共焦显微镜由于其高分辨率、高灵敏度、高放 大率等特点，在细胞水平上可作多种功能测量和分析，成为分析细胞学的一 项重要研究手段。而全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生 物光学显微技术之一，可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。
二.生物细胞中汞离子的探测
在这一主题中，着重研究了BNPTU在生物细胞中的应用。 探讨了生物细胞的选择以及培育方法，详细研究了探针在 细胞内的状态，分析了探针在细胞被汞离子污染前后的荧 光光谱。
3．1生物细胞的选择和培育 单细胞的纤细裸藻(Euglena gracilis 277)被我们选做模型进行活体 探测。纤细裸藻是淡水性微小单细胞真核生物，在植物学上归为裸藻 门，动物学上归为原生动物门，因此它同时具有动物和植物的特性。 同时，它还有很强的吞噬外界物质的能力。纤细裸藻被大量的用于毒 性和环境测试。并且被认为是在环境污染尤其是工业污染的生物测试 中的一种标准生物指示剂。
1．1．1共焦荧光显微术
1．1．2全内反射荧光显微术 细胞内含有多种分子机器，涉及细胞运动、DNA转录加工、细胞信号转导、 蛋白质合成和蛋白质折叠等多种过程，这些分子机器在活细胞中协调运作， 使细胞功能得到发挥。传统的分子和细胞生物学技术已经比较深入地阐明了 分子机器中生物分子的构成及其所扮演的角色，但是单个分子的活动却被平 均化而观察不到。迄今为止，在细胞生物学领域所进行的研究，绝大部分是 集合平均(ensemble averaging)效应，而不是单分子研究。 荧光单分子检测技术(single molecule detection)是用荧光标记来显示和追 踪单个分子的方法。由于荧光信号测量灵敏度高以及光子对分子干扰最轻微， 全内反射技术被广泛应用于单分子研究．尤其对于需观察细胞内单分子实时 变化的细胞生物学研究。全内反射被认为是非常有效的技术。全内反射荧光 显微术成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途 的光学成像技术。现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆 球蛋白分子的运动、单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移、ATP酶的翻转， 聚合物内单个分子的结构变化以及等离子体膜附近的神经分泌腺的颗粒运动 等多方面。
通过激光扫描共焦显微镜，我们 首先观察吞噬了1和Hg2+的细胞的荧光 图像。因为1和2的荧光光谱峰值分别 在550 nm和495nm附近，所以我们选用 505—550nm的滤色片来滤去激发光和 680nm左右的叶绿素的荧光。通过光谱 分析(见图3．3)可知，细胞内的荧光 分布主要是2产生的(可能含有少量未 反应的1)，2在细胞内的三维分布如图 3．2(A)所示，其中主图展示的是细胞 内X-Y平面的荧光分布，主图右侧和下 面显示的则是X-Z与Y-Z的剖面图。我 们可以看到2在细胞中的分布是比较均 匀的。同时我们测量了细胞的DIC (differential interference contrast)图像，来观察其形态．图 3．2(C)则是(A)和(B)的合并。通过观 察荧光像可以确实证明细胞吞噬了探 针和Hg2+。我们同时观察了用来做对比 的只吞噬了1的细胞，得到了相似的荧 光像。
得到的的荧光探针BNTPU比传统的荧光探针 有着明显的优势：
(1)相对于大部分探针显示的荧光强度变化而言，BNTPU最大的特点就
是在探测汞离子的时候显示的是光谱位移。由于汞离子的嗜硫性，可以使原 来的硫脲基团转变成半族咪唑，这样就会缺失很多电子授予基团，因此会带 来大量的荧光团的电子失位的损耗，从而使得BNTPU探测汞离子的时候显示出 显著的光谱蓝移。这样可以排除溶液浓度变化对荧光强度的影响，在很大程 度上避免了由于复杂生物环境所带来的浓度分布不均匀引起的测量误差. (2)BNPTU具有很高的双光子吸收截面。由于双光子在生物探测中有着重要 的应用，双光子吸收性质在最近得到极大的重视。双光子过程在生物应用中 有着许多优点：它穿透性强：可以得到很好的空间分辨；红外光激发可以减 少生物损伤：可以有效的避开生物体的自体荧光等等。
2．3汞离子荧光探针BNPTU
本实验中使用的汞离子荧光探针是由华东理工大学化学系合成的。他们
对原先合成的汞离子荧光探针进行改进，取得了具有较高的溶解度和溶解速 率以及较大的双光子吸收截面的新型探针。荧光探针的合成过程以及与汞反 应生成的产物如图2．1所示。
2．3汞离子荧光探针BNPTU
图2．1 BNPTU的合成过程以及与汞离子反应以后结构的变化。
图3．2(A)细胞内2的荧光图像。主要的那副 图像展示的是细胞内X．Y平面的分布，右侧 和下面的 则是X．Z与Y的剖面 (B)DIC图像 (c)图像A 和B的合并
3．3单光子激发和双光子激发的比较。 研究可知，l和2的双光子吸收截 面分别为4．1士0．4和13．4士1．8， 而riboflavin和FAD的双光子吸收截 面分别为1．23和0．035，探针的双 光子吸收截面远大于细胞内主要荧光 物质黄素的双光子吸收截面。因此， 使用双光子激发，必定可以得到更好 的信噪比，从而来提高探测的灵敏度。 为此我们将探针的单光子、双光子光 谱和细胞自体荧光的光谱进行了对比， 我们通过前面得到的细胞荧光像。选 择某一微区测量得到的荧光光谱如图 3．3所示。其中。曲线1表示未经汞 离子孵化的细胞中的1的光谱，曲线2 表示用汞离子孵化后的细胞中的2的 图3．3细胞中探针的单光子激发(A)和双光子激发 光谱，曲线3为细胞的自体荧光光谱。 (B)的荧光光谱。其中曲线1表示1(1×10-7M)孵化