第五章 减压柱色谱分离技术

由于经典的柱层析费时费力，需要大量的固定
相和洗脱液，工作效率低，为此人们相继建立 了离心薄层、 VLC、 FCC 等快速层析分离的 方法。其中VLC在天然产物分离中应用最多。 该法1969年由澳大利亚Coll J.C提出，1977年首 次应用于分离澳洲软珊瑚中 2 个新的二萜化合 物(Cembrenoids).
1 9 7 9 年 美 国 Targett.NM 将 该 法 命 名 为
Vacuum liquid chromatography (VLC), 并 且详细报道了实验装置和操作方法。
从此以后， VLC 便逐渐为广大化学家所
接受，并且在实验装置上作了进一步改 进。
一、VLC特点
VLC 实 质 上 是 柱 色 谱 ， 它 综 合 了 制 备 薄 层
10um～40um 硅胶60H或60G）聚酰胺 等 2. 装柱：干法装柱法。 将吸附剂装Hale Waihona Puke Baidu漏斗或短柱中，轻轻拍 紧或减压拍打或从顶端挤压，直至吸 附剂紧密，最后变得坚硬。吸附剂的 高度一般不超过5cm。
3，吸附剂用量：
（ 1 ）对于微量分离，样品＜ 100mg, 可采用直径 为 0.5 ～ 1cm色谱柱或漏斗，吸附剂高度为 5cm， 一般固定相用量为10～15：1倍，如图4-a,可在 小试管中收集流分。 （ 2 ）对于 0.5 ～ 1.0g 样品，柱中装有 2.5 × 4cm高 度的吸附剂较合适。 （ 3 ）对于 1 ～ 10g 样品的分离，可在柱中装入 5×5cm的吸附剂。 （4）较大样品分离，最好采用250ml砂芯漏斗中 进行。吸附剂的高度为5cm。（如图b）可用三 角烧瓶收集之。 加大吸附剂与样品比例，可提高分离度。常 用比例为30：1～300：1
d． VLC处理量大．分离几十克的样品，仍能
以较快的速度完成。在 FCC中，由于玻璃分离 柱的限制，处理6g以上的样品时就常困难．常 压柱层析虽然没有样品量的限制，但是极其耗 时，所用的固定相的量亦很大， e. VLC特别适用于频繁的梯度淋洗，并可使固 定相抽干，这又是 FCC和常压柱层析无法做到 的， f． VLC可以作为进行HPLC分离前的较理想的 预处理方法． VLC 法也有不足．在使用低沸点溶剂 ( 如石油 醚 ) 时．要严格控制好真空度，防止大剂量溶 剂挥发。
（Preparative PTLC）和真空抽滤技术。 VLC 不同于常压柱层析和快速柱层析 Fcc，因为后 两者洗脱剂是连续的，在操作中不会间断；而VLC 进行溶剂洗脱时，在加洗脱剂后，在柱后减压下全 部抽出，每一次洗脱收集一次，抽干后，再更换溶 剂，并再进行下一个流分的收集，所以在这一点上 VLC 与 PTLC 多次展开极为相似。（展开一次后吹 干，再展）。 FCC采用柱前加压，而VLC采用柱后加压。 VLC可分离样品量达几十克，而FCC只能分离几克。
五、洗脱与收集
用适当溶剂系统洗脱或用梯度洗脱（gradient
elution）。 在常压下，加入溶剂后，将柱抽干，收集为 一个流分。真空度要求 20 ～ 70mmHg；抽干 后再更换溶剂和容器，重复以上操作，并用 TLC 跟踪每一个流分的分离情况（先摸一摸 再行动）。 为避免每一流分拆卸漏斗，可采用图 B 的方 法，该抽滤甁底部为磨口，减去负压后，更 换接受甁。
1. 首先用洗脱剂流经吸附剂，抽滤至近干，约 有 1 滴 /1 － 2 秒洗脱液流下。或用湿润的硅胶 装柱，吸滤至干，再加 40 ％体积的滤液到漏 斗中，抽至与吸附剂一直的水平面下。 2. 样品溶解或稀释用洗脱液，加到湿的吸附 剂表面上抽至吸附剂表面相平，溶液的厚度 不可高于5mm。如果溶液的体积较大，可分 次抽真空加入，操作同上。当所有的样品溶 液已加入，开始洗脱，按照同样方法。每一 份洗脱液加入后通过吸附剂抽至半干1滴/1－ 2秒。
（2） l．0克 pH 9-12的 Acontium columbianum粗
提 生 物 碱 混 合 物 ， 使 用 6 5 gTLC 用 Al2O3 60 (Merck,H basic,Type E，EM1085)． 甲苯：氯仿＝1：4(V／V)洗脱， 于28-30号流份中 得到 talatizamine(3)265mg; 氯仿:甲醇＝19：1洗脱，于35-36号流份中分离得 到 cammaconine(4)247 mg。 从两个化台物结构来看，只是在 C—18位上有细微 差别．若采用 PTLC法分离，操作极其繁琐、费时， 且消耗大量吸附剂与展开剂．两法相比， VLC 明 显优于 PTLC．
（3）利用 VLC成功分离海洋腔肠动物的正己
烷提取物．将在日本冲绳近海采集到的一种软 珊瑚腔肠动物 Anemonia sulcatas切碎后用丙酮 浸出，浸液浓缩后用正己烷提取，得提取物 12.5g, 溶解于70 ml正己烷：乙酸己酯＝8：2的 混合溶剂，用滴管将此溶液均匀添加到硅胶表 面．抽真空，洗脱溶剂从正已烷开始，直至最 后用乙酸乙酯，梯度洗脱，每次收集200mL， 共收集2 L，耗时2小时． 结合 TLC和核磁共振谱，非常满意地分离和确 定了10余种萜类、脂肪酸及其酯、甾体化台物 (见图)．若用常压柱层桥，需要370g硅胶，费 时30小时，耗用10 L溶剂，才得到同样的效 果．
VLC吸附剂经处理后可反复使用。
二、实验装置与操作
1986年，Coll和Bowden曾介绍过一种
十分简单的用于实验室小规模的减压 液相色谱法装置（图－a,b）。
Pelletier在1986年，介绍可使用于较大规模的分
离的装置（图－2）
1.固定相； 常 采 用 TLC 用 硅 胶 、 Al2O3,（ 粒 度 ：
三、上样
放掉真空后，常压下加入低极性
溶剂于吸附剂表面上，减压使溶 剂均匀流过吸附剂。如有空隙， 需要重装。使柱子抽干后，重复 1～2次，即可准备上样。
A．用低极性溶剂或洗脱剂（如石油醚、 正己烷）溶解样品。常压下小心加入 柱顶端，再加入洗脱剂或溶剂覆盖吸 附剂表面，慢慢减压，使样品在柱顶 端形成样品层。 B．可也采用固体上样法。即先将样 品溶于极性溶剂，加入5～10份吸附 剂，旋转蒸发至干后，加到吸附剂的 表面上，然后进行洗脱。
Semi-Dry Column Chromatography SDC
第一节 真空液相色谱技术 Vacuum Liquid Chromatography
真空液相色谱法，简称VLC，也称减压液相色
谱法。 是近几年来国外实验室迅速发展起来的新技术， 它是利用柱后减压使洗脱剂迅速通过固定相从 而很好的分离样品的色谱技术。 VLC具有快速，简易，高效，价廉等优点，目 前已成功的应用于有机制备以及天然产物如萜 类，类酯，双萜及多种生物样品的分离。
六、应用实例
1. VLC 法可用于合成反应混合物的分离．
delphinine(翠雀花碱)于220℃， 0．1 mmHg下
发生裂解反应，生成 Pyrodelphine (焦翠雀 灵)．两者的混台物用甲苯：丙酮＝24：1洗脱， 得到896mg Pyrodelphinines; 甲苯：丙＝19：1 洗脱，得到108 mg Delphinine．分离全程仅仅 花费2小时．
2. VLC法用于多种天然化合物的分离 （1）曾有人用VLC法对姜中辛辣成分的分离 先将冷冻干燥的姜粉用丙酮提取，经过一系列溶剂分 配后，得所需部位。 选用一内径为 3.5cm 的 100ml 的布氏漏斗内装硅胶 60 （40～63μm,Merck公司）9.5g, 高度3cm. 300mg 姜提取物的溶液与硅胶 60 混和，蒸发除去溶剂 后，均匀分布于硅胶柱床表面上，并在样品表面上覆 盖一张与漏斗内径相同的滤纸，缓缓加入 25ml的己烷。 待溶剂透过柱床后，开始减压抽干柱床，得第一流分。 继续用极性增大的溶剂（己烷－乙醚－乙醚－甲醇） 洗脱，每份 25ml，共得20份洗脱液，利用该法可将姜 醇与姜烯酚完全分开。
七. 小 结
综上所述，与常压柱层析和快速柱层析相 比，真空柱层析具有以下特点： a．分离操作时间短，一般仅需数个小时， b．装置简单、易得，装柱方便，且要求不 高， c．分离效果好，这主要是由于固定相的细 小颗粒(平均10 μm)、较大的表面积 ( 500 m2/／g) 和合理的装柱方法的原因，
第二节 半干柱液相色谱
Semi-Dry Column Chromatography SDC
半干柱液相色谱即在柱后减压时将固
定相抽之半干的液相色谱。
Peter Vinezev等1991年报道利用半干
柱液相色谱法对Wittig反应中的差向 异构体的分离。
一、色谱柱的制备
应用砂芯漏斗或短层析柱，装入1：1硅胶60
（70－230目）与硅胶HF（薄层层析用规格） 的混合物。 硅胶床的高度 5-8cm，再高对分离结果无明 显提高。对于较大量样品的分离可用较大的 砂心漏斗，同样可以得到较好的分离效果。 有关SDC的实际操作数据包括漏斗直径，装 入硅胶量，每一洗脱剂量及被分离样品的关 系见表：
漏斗直径 packing：
I 200
II 120
III 90
IV 65 30 30 30 1～5
V 40 10 10 8 0.1～1
硅胶6070～230目 500 硅胶HF 每一流分体积 样品量（g）
200 100 500 200 100 160 80 60 30～50 10～30 1～10
二、洗脱与分离：
四，VLC流动相选择
与柱层析相同，先用 TLC 来选择条件。 VLC 更
适用于梯度洗脱，可用二元，三元混合溶剂系 统。一般先用极性较小溶剂，如石油醚、正己 烷、环己烷，然后逐渐加大极性 （ CH2Cl2、 Et2O、AcOEt、CH3OH） 极性溶剂的增加开始要缓慢（1%，2%，3% 等），然后增加的幅度可逐渐增大（5% 10% 20%等），通常收集20～25个流分可将所有成 分洗脱。
经过 SDC 分离，下列 Wittig 反应所得顺式 、
反式产物可以得到较好的分离。


Ph3PCH2RBr
t-BuOK Ph3P-CHR PhCH3,t-BuOK
RCHO
RCH=CHR' + Ph3PO
Z顺式 E反式
第五章
减压柱色谱 分离技术
为加快柱分离的速度和/或增加分离 度，通常采用在柱前加压和柱后减压的 方法进行柱层析与分离。 —柱前加压法通常称为加压柱色谱 —柱后减压法通常称为减压柱色谱
第一节 真空液相色谱技术
Vacuum Liquid Chromatography 第二节 半干柱液相色谱