甲基化实验步骤

一．重亚硫酸盐修饰基因组DNA的制备

采用EZ DNA Mehtylation-Gold Kit TM D5005试剂盒，按照操作说明书分别对提取的Blank、Cya基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰。

1.分别吸取10μL Blank和Cya DNA样品到PCR管中，加入10μL 水补足20μL，每个

样品加130μL CT conversion reagent。轻弹管子或者用枪吹打混匀，离心使液体沉到管底。

2.将管子放到热循环仪中，运行以下步骤：

1.98℃ 10min

2.64℃ 2.5h

3.4℃保存可至20h

3.加600μL M-Binding Buffer 到Zymo-Spin TM IC Column, 柱子放在提供的收集管中。

4.把样品（来自步骤2）加到装M-Binding Buffer的Zymo-Spin TM IC Column中。盖上盖子，

颠倒混匀。

5.全速离心（≥10000g）30s。倒掉流穿液。

6.加100μL M-Wash Buffer到柱子上。全速离心30s。

7.加200μL M-Desulphonation Buffer 到柱子上，室温（20℃-30℃）静置15-20min。孵育

完成后，全速离心30s。

8.加200μL M-Wash Buffer到柱子上。全速离心30s。另加200μL M-Wash Buffer，再离

心30s。

9.把柱子放到1.5mL离心管。垂直加10μL M-Elution buffer到柱子基质。全速离心30s

洗脱DNA。

二．PCR扩增反应

模板：重亚硫酸盐修饰的Blank、Cya基因组DNA

引物

上游：CTCAAGCTTCGAATTTTTTTATAAGAAGAAGATA TAG

下游：TAGATCCGGTGGA TCAAAACTCCACCACAAACCACTT

目的片段长度：476bp

1. 操作步骤：

反应体系

模板0.5μL

10×KOD plus buffer 5μL

dNTPS Mixture（2.5mM each）5μL

Mg2+4μL

上游引物3μL

下游引物3μL

DMSO 4μL

KOD plus酶2μL

ddH2O 23.5μL

Total 50μL

反应条件：

1）95℃ 3min

2）95℃ 25s ；48℃ 15s ；72℃ 45s 。35Cycles

3）72℃ 10min ；4℃ ∞ 。

电泳

将上述50μL PCR 产物与10μL 6×Loading Buffer 混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳：125V ，25min ；凝胶图像分析系统观察结果，拍照。

结果：

M Blank Cya

目的片段切胶回收

按照AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。

1. 在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶

体积。

2. 加入3个凝胶体积的Buffer DE-A ，混合均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶

块完全熔化。

3. 加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B ，混合均匀。

4. 吸取步骤3中的混合液，转移到DNA 制备管中，12000×g 离心1min 。弃滤液。

5. 将制备管置回2mL 离心管，加500μL Buffer W1, 12000×g 离心30s ，弃滤液。

6. 将制备管置回2mL 离心管，加700μL Buffer W2, 12000×g 离心30s ，弃滤液。以

同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，12000×g 离心1min 。

7. 将制备管置回2mL 离心管中，12000×g 离心2min 。

8. 将制备管置于洁净的1.5mL 离心管中，在制备膜中央加25μL 加热至65℃的去离

子水，室温静置1min 。12000×g 离心1min 洗脱DNA 。

三． 重组

1. YFPC1质粒EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切

将抽提好的YFPC1质粒按以下步骤进行双酶切。

反应体系：

EcoR Ⅰ 1μL

BamH Ⅰ 1μL

YFPC1质粒 5μL

10×K 2μL

H 2O 11μL

2000

1000 750

500

250 100

共4管

反应条件：37℃ 2h

酶切完成后，4管合成2管，1%琼脂糖凝胶检测，结果正确。切胶回收。

2.连接

采用GenaCopoeia Fast-Fusion TM克隆试剂盒。

反应体系：

YFPC1双酶切产物 5μL

目的片段3μL

10×Clonase Buffer 1μL

Fast-Fusion TM Clonase 1μL

轻弹管壁使配置好的反应液分散均匀。25℃温育15min。冰上保存直至转化。

四．转化

1.从-80℃冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液，室温解冻，解冻后立即置于冰上。

2.将重组产物全部加入感受态中，轻弹混匀，冰上放置30min。

3.42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min。

4.向管中加入800μL 无抗LB液体培养基，混匀后摇床37℃，200rpm培养1h。

5.菌液5000rpm离心5min，倒掉上清，混匀，均匀涂于LB（K+抗性）平板，37℃培养箱培

养过夜。

五．摇菌测序

分别挑取Blank、Cya组20个转化子，3mL LB（K+抗性）培养基37℃摇床200rpm过夜培养。菌液送测序。