环介导等温扩增技术原理 ppt课件
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环介导等温扩增技术原理
烟雨莫问
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1
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
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2
等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程 始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性 的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速 核酸扩增的目的。
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区 域组成，和靶基因的B3c区域互补。
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10
LAMP反应引物与对应模板区域
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11
内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成， 合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新 的双链DNA。
形 成
基 础 结 构
LAMP
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14
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15
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16
Effect of reaction time on the LAMP reaetion.Lanes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction.
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5
温度 ℃ 引物 模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4条 需要 不需要
DNA DNA DNA RNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要 求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足 快速简便的需求。
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3
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
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4
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
pptபைடு நூலகம்件
8
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
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12
以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP 为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端 F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。
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13
引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链， 并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开， 外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链， 并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和 BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然 发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成 两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP 的基础结构。
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及
进行温度循环。
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9
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。
LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则 只有内引物被使用。
乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D].
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基 因5’端的Flc区域序列相同。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成， 并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和 B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
DNA聚合酶
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6
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模 板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的 连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。
操作简单：只需一个水浴锅
快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环 而造成 的时间损失
特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区 域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异 性极高。
高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数 量级的差异。
缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在 300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的 扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。
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7
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计 的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新 技术。
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等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程 始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性 的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速 核酸扩增的目的。
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区 域组成，和靶基因的B3c区域互补。
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LAMP反应引物与对应模板区域
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内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成， 合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新 的双链DNA。
形 成
基 础 结 构
LAMP
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Effect of reaction time on the LAMP reaetion.Lanes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction.
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温度 ℃ 引物 模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4条 需要 不需要
DNA DNA DNA RNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要 求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足 快速简便的需求。
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特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
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环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
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60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
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以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP 为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端 F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。
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引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链， 并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开， 外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链， 并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和 BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然 发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成 两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP 的基础结构。
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及
进行温度循环。
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针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。
LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则 只有内引物被使用。
乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D].
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基 因5’端的Flc区域序列相同。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成， 并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和 B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
DNA聚合酶
ppt课件
6
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模 板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的 连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。
操作简单：只需一个水浴锅
快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环 而造成 的时间损失
特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区 域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异 性极高。
高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数 量级的差异。
缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在 300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的 扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。
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环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计 的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新 技术。