重组体的筛选和鉴定

1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。

转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
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（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
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二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理

具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18

19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
β链：β—半乳糖苷酶活性
α-互补 （酶活）
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原理：



载体—编码β-半乳糖苷酶氨基端（N端）的α肽，其上有外 源DNA的插入位点， LacZ-受体菌(lacZ∆M15)—编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端） 片段（片段缺失）。 基因内互补（α-互补）：完整有功能的-半乳糖苷酶 lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，无外源DNA片段插入时， 质粒表达β-半乳糖苷酶的α-肽，与宿主菌表达的lacZ基因产 物（β链）互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，在显色底物 X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现蓝色； 外源基因插入后，破坏了lacZα肽基因的结构，细菌内不能 产生β-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。
7
重组质粒DNA携带抗药性基因，转化后受体菌在含有相应抗生 素的培养基上生长，而不含此载体DNA的受体菌不能存活。 8
（2）插入失活/表达筛选
①插入失活：外源DNA片段插入载体的标记基因序列中，导致该 基因结构破坏而失活，使转化细胞丧失该基因表型。
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利 用 抗 生 素 抗 性 基 因 筛 选 重 组 子 的 过 程
5
常用的抗生素抗性基因
1) 四环素抗性基因（Tcr） Tetracycline 可结合核糖体30s亚基中的一种蛋白质分 子，抑制核糖体的转位过程。 四环素抗性基因编码一种399AAs蛋白质，与细菌细胞膜 结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的 活性。 Apr抗性基因编码分泌到细菌细胞周间质的β—内酰胺酶， 催化β—内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
10
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
Amp r Tcr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
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-半乳糖苷酶使X-gal分解成兰色产物。
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（4）噬菌斑筛选法



λDNA载体系统：重组DNA分子在野生型λDNA长度75％-105％ 范围内，才可以在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒， 转导受体菌，在培养基上形成清晰噬菌斑 未转导的受体菌继续正常生长。 替换型λ载体：噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子，空载的 λDNA分子不能被包装。 插入型λ载体：空载的λDNA大于包装下限，也能被包装成噬 菌体颗粒并产生噬菌斑，筛选重组子可以利用λ载体上的筛 选标记基因:如lacZ LacZ’
BamHI片段(Tcr)
pBR322
PstI(Apr)片段 重组分子Ⅱ(Aps Tcr) 重组分子I (Apr Tcs）
PstI片段
外源DNA
BamHI 重组分子I 重组分子Ⅱ 分别转化E.coli (ApS TcS) 涂布Ap平板 涂布Tc平板 Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
②插入表达筛选法

外源目的基因插入
激活
筛选标记基因的表达。
下游

筛选标记基因上游 负调控序列 的筛选标记基因表达。
插入失活
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插入表达

pTR262质粒载体，其Tcr基因的上游含有CI阻遏蛋
白编码基因，表达的阻遏蛋白抑制Tcr基因的表达。 当外源DNA片段插入CI基因的HindⅢ或BglⅠ位点
上时，CI基因失活．Tcr基因表达，故阳性重组子
重组体的筛选和鉴定
1
外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的几种 情况：
转化 E.coli
（1）
（2）
（3）
2
把采用各种转化方法或转导方法获得的含有外源DNA分子
并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞叫做转化子
（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子） 含有重组DNA分子的受体细胞被称为重组子， 重组子筛选： （1）把携带有外源DNA片段的克隆挑选出来；32Pຫໍສະໝຸດ 或125I。
荧光素，生物素 (biotin) 、地高辛等
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32P
32P
＋
放射自显影
重组质粒
标记探针
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利用探针与靶DNA杂交，可识别靶DNA中的特异核苷酸序列 优点：（1）具有高度的特异性和敏感性。
（2）不要求外源基因的表达。
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核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
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3) 氯霉素抗性基因（Cmr） Chlorophenicol可结合核糖体50S亚基，阻止蛋白质合成。 Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰 化的氯霉素不能结合在核糖体上。
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷 类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。 抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。
或用合适的内切酶切下插入片段，再用其它酶切这个片段，
电泳后比较结果是否符合预计的结果。
连接时使用双酶切片段和载体时，可以用原用的两种酶 来酶切鉴定
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DNA Marker 加 样 孔 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的PCR扩 增片段 双酶切鉴定
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A
B
C
M
bp
—1534 — 994 — 695 — 515 — 377
dTTP 二氢叶酸还原酶 dGTP 四氢叶酸 阻断 氨基喋呤(A) 补加次黄嘌呤（H）
HGPRT
二氢叶酸
死 亡 存 活
dATP
tk tk+细胞中：胸苷(T)→胸苷-磷酸→dTTP •以tk－为受体，载体中加入tk基因， •HAT选择培养基中tk+细胞成活，tk-细胞不能成活 •则阳性重组子可在HAT中成活。
（2）把携带有特定外源插入片段的重组子挑选出来。
3
一、 重组克隆的初步筛选
（一）遗传学检测

根据重组子的表型特征，直接筛选(Screening)。
载体提供
遗传表型 外源DNA提供
4
1、利用载体的表型特征筛选重组体
（1）抗药性筛选
抗药性：载体带有抗药性基因，受体细胞没有
营养缺陷型筛选：载体携带某种必需营养组分的合成基因，受 体细胞没有
成的寡核苷酸单链与RNA或DNA单链之间进行。

杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性
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探针
广义上讲是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被 特殊方法所检测的分子. 核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异互补杂交，杂交 后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。 识别标记 （1）放射性同位素 （2）非放射性标记
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紫外光照 GFP 发绿色荧光
GUS
GUS 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸 蓝色水解产物
4-甲-β-D-葡糖醛酸
荧光产物
β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucuronidase，GUS）基因：编码一种可分解各 种β-葡萄糖苷酸的水解酶。
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②筛选哺乳动物细胞常用的遗传标记

TK(thymidine kinase，胸苷激酶）， HGPRT(黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖基转移酶）二氢叶酸还原酶（DHFR）
1、快速裂解菌落直接电泳检测法
原理：有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分 子量大。 方法：从转化后的菌体克隆中分 离质粒，电泳、比较其分子量。 凝胶电泳分离：质粒DNA的电 泳迁移率与其相对分子质量大 小成反比。
分子量 Marker
重组 克隆
载体
32
2、酶切鉴定 （1） 原理：
根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内 切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
3’
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT TACTGGTACTAATGCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTAGCTTCGAACCGTGAC
KpnI BamHI SalI (26aa) PstI β-galactosidase coding sequence XbaI SmaI XmaI AccI HincII
Charon16A EcoR I
25 25
（5）载体提供动植物转化细胞常用的标记基因
①筛选植物细胞报告基因（reporter gene)：NPTⅡ, HPT, LUC 报告基因：是某种生物的特定基因，装配在载体上成为载体结 构的一部分，具有指示的功能 常与目的基因融合表达，以示踪目的基因的表达和位置
— 237
35
36
3、PCR检测
（1） 原理
PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。
（2） 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）引物：外源DNA或载体克隆位点两侧序列，PCR。 （3）电泳PCR产物。
（4）检查是否有PCR产物。
（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
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A
SphI
HindⅢ
21
α 互 补 的 检 测
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转化菌株 pUC19 rDNA
含APr, X-gal和IPTG培养基 Z基因失活、不表达β一半 乳糖苷酶、X—gal不被分解
菌落颜色 无色(白颜色)
pUC19DNA (自身环化）
Z基因表达β一半乳糖苷酶
蓝色
假阴性：如果插入的外源DNA较短，正好是3的倍数并且没有 终止密码；（不破坏肽）。
提取DNA 电泳
Amp r Tc s
重组DNA
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四环素加环丝氨酸筛选：
a.四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失 活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，
保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨 酸杀死。 四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。
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2、利用插入序列的表型选择
原理

转化入细胞的外源DNA编码基因能够对宿主菌株的表型发
生体内抑制或互补效应，从而使转化后的宿主细胞表现出
外源基因编码的表型特征。

要求：克隆基因片段必须含有一个完整的基因序列，并在 大肠杆菌等原核生物中得到表达 特定基因的功能

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（1）弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突 变型缺陷。
环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
12
12
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b.氨苄青霉素抗性插入失活 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活， 可用碘-青霉素指示液选择。 β-内酰胺酶裂解青霉素β-内酰胺环，形成青霉噻唑酸与淀粉 竞争游离碘,破坏了碘和淀粉的蓝色复合物,使蓝色变为无色。
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受体菌： 外源基因：
hishis+
在不含组氨酸的培 养基中生长
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（2） 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
例：小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR
连接
转化受 体菌
三甲氧苄二氨嘧啶培 养基平板
载体 含DHFR的克隆才能生长
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31
（二） 依赖于重组子结构特征分析的筛选