植物病理学实验技术指导(第二版)
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转化过程所用的受体细胞一般都是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切 酶和甲基化酶的突变体，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体 细胞经过一些特殊的方法（电击法，化学法等）的处理后，细胞发生了暂时的改变，成 为了能允许外源DNA进入的感受态细胞（Competent cells）。进入受体细胞的DNA分子 通过复制，表达实现遗传信息的转移，是受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的 细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子。
1．From single colony, start 5 mL overnight in YPD. 2．In the morning seed a 50 mL culture with 0.5 to 1.0 mL saturated overnight. Grow to
OD=0.4-0.6 (usually 8 am to around 2:30 pm is sufficient ). 3．Spin 5min @ 3000rpm (sorvall table top is fine ). 4．Resuspend / wash ×2 in 10 mL 1×TE/LiOAc. Spin 5min @ 3000rpm. 5．Resuspend in 250uL 1×TE/LiOAc and use 50 uL for transformation. These can be left on
Add ddH2O to 100ml Store at 4℃
Ⅲ*、Vitamin Solution
0.01g
Biotin
0.01g
Pyridoxin
0.01g
Thiamine
0.01g
Riboflavin
0.01g
PABA(P aminobenzoic acid)
0.01g
Nicotinic Acid
静置时间不宜过长，PTC 对原生质体会有毒性。加好后去解冻 TB3 固体培养基 3、把原生质体加到 10ml 左右熔化后冷却至 45℃-55℃的 TB3 固体培养基中（含 50ug/ml Amp），轻轻混匀后倒入培养皿中 28℃黑暗培养 24h 培养基温度越低越好，解冻后放于 45℃水浴中防止其凝固；培养基的量也可多加， 分倒于多个皿中。 4、往培养皿中再倒入 10ml 含 300ug/ml HygromycinB 的 TB3 固体培养基（最好含 50ug/ml Amp） 5、28℃下黑暗培养 7-10d 后挑出转化子，一般 5d 后即可看出转化是否成功 6、在含 300ug/ml HygromycinB 的 TB3 固体培养基上再次筛选验证转化子。 ◆注意事项： 原生质体非常脆弱，操作过程中动作要轻 溶液配制要精确，需用ddH2O配制 器皿要绝对干净
为 150ul/管。立即转化或保存于-70℃。最好立即转化，一般不保存。 二．转化（Transformation）
1、将 2ug DNA（5-10ul）加于 150ul 原生质体中，轻轻混匀，室温静置 25min DNA 浓度需足够大，且要干净
2、分 2-3 次加 1mlPTC，轻轻混匀，室温静置 25min
CaCl2
4、TB3
Autoclave
3g
Yeast Extract
3g
Casamina Acids
20%
Sucrose
Add ddH2O to 1L for solid media add agar to 0.65-0.75% Autoclave 5、PTC
60% （w/v）
PEG4000 in 1ⅹSTC
水冲洗步骤可有可无。 5、将菌丝置于盛有 10-20ml 酶液（含 50ug/ml Amp）的 50ml 离心管中酶解。离心
管平躺，30℃ 60rpm 2-3h。 酶解过程中应吸取菌液镜检，检查原生质体是否释放；酶液需现配现用，PH 值很
关键，需用低浓度（0.1M）的 NaOH 调 PH 至 5.8。 * 以下步骤于 4℃下完成，0.7M NaCl 溶液,1ⅹSTC 先放于 4℃预冷。 6、取出酶解液，加少许 0.7M NaCl 溶液，轻轻摇晃，倒于三层擦镜纸过滤，用 0.7M
植物病理学高级实验技术指导
（植物病理学专业研究生使用）
南京农业大学植保学院植物病理学系 2010-09
植物病理学实验技术
第一部分 真菌学实验技术
实验一 稻瘟病菌转化（Transformation of Magnaporthe grisea）
一．原生质体的制备（Protoplasting） 1、活化菌株，接种菌丝块(2mm×2mm)于 CM 平板上生长 6d 左右，菌落直径约 3cm，
漏斗 烧杯 玻璃棒 培养皿等。以上器材全需湿热灭菌处理，全部操作于超净工作台中完成。
实验二 酵母转化（Yeast Transformation）
Solutions: 10×TE=100mM Tris·HCl pH7.5, 10mM EDTA 10×LiOAc=1M LiOAc 50%PEG 4000 (only good for about 6 months)
在不同的细菌中，感受态的形成机制也有所不同。对于枯草芽孢杆菌来说，自然感 受态是对数生长后期在一种二元信号转导系统的调节下形成的，需要一系列相关基因的 表达。按照这些基因的功能和表达时间的先后，它们被分为早期感受态基因和晚期感受 态基因。其中早期基因主要对感受态的形成起调节作用，并进一步促使晚期感受态基因 的表达。而后者主要负责细胞对外源DNA的吸附、吸收和重组。在枯草芽孢杆菌中如果 感受态形成基因缺失则会导致转化的困难。 二、实验材料： 受体菌株：Bacillus subtilis 168 待转化质粒：pAD43-25（Cm+,Amp+）(此质粒是穿梭质粒，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 中都可以复制,并能组成性表达GFP) 培养基：LB液体和固体培养基 其他材料：（以下物品均需灭菌） 1.5mL 离心管，枪头，空试管，涂布棒，培养皿等 试剂： 1，SPI－A Salts Solution：（100 ml Solution）
Add ddH2O to 100ml Store in a dark glass bottle at 4℃
2、5ⅹ YEG
5g
Yeast Extract
10g
D-Glucose
3、1ⅹ STC
Add ddH2O to 1L Autoclave
20%
Sucrose
50mM
Tris•Cl PH 8.0
50mM
第二部分 细菌学实验技术
实验一 枯草杆菌化学感受态制备及转化方法
自然条件下，很多细菌均可以从外界环境中摄取外源DNA，使之获得新的遗传变异， 从而更好的适应环境条件。当然，枯草芽孢杆菌也不例外。在分子生物学高速发展的今 天，通过人工的方法也可以使细菌获得从外界摄取外源DNA的能力，从而使受体菌获得 新的遗传性状，这一过程叫做转化（Transformation）。枯草芽孢杆菌的转化有多种方 法，比如化学转化，电转化，原生质体转化等，但目前比较常用的是化学转化方法。 一、原理：
三．所需试剂及培养基（Reagents and media）
1、CM 培养基： 50ml
20ⅹNitrate Salts*
1ml
Trace Elements*
10g
D-Glucose
2g
Peptone
1g
Yeast Extract
1g
Casamina Acids
1ml
Vitamin Solution*
0.2％ (NH4)2SO4 1.4% K2HPO4·3H2O 0.6% KH2PO4 0.1% Trisodium Citrate Dihydrate (柠檬酸三钠) pH=7.2 121 ℃灭菌20 min 2，SPI－B Salts Solution：（100 ml Solution） 5% MgSO4·7H2O （5 g MgSO4·7H2O加双蒸水定容到100 ml） 121 ℃灭菌20 min 3，100× CAYE Solution：（100 ml Solution） 2％ Casamino acid 2 g 10％ Yeast Extract 10 g 121 ℃灭菌20 min 4，50％Glucose（葡萄糖）（单配，50％W，即125g/250ml 溶液，115℃灭菌20 min） 5，50 mM CaCl2 （单配，121℃灭菌20 min）[100 ml: 0.073 g 的CaCl2·2H20（MW:147.02）
菌株不宜太老，最好不要超过 12 d。 2、切取直径约 3cm 的菌落，尽量切碎，置于约 100ml CM/5ⅹYEG 的液体培养基
中（含 50ug/ml Amp），28℃，150rpm，过夜。 3、往瓶中再加 50ml 左右液体培养基，最好含 Amp，28℃ 150rpm 过夜视菌丝
生长情况，如果菌丝生长缓慢，可再加培养基，延长培养时间，但要尽量防止其变黑。 4、收集菌丝，用四层擦镜纸过滤，无菌水冲洗两遍，用吸水纸将水稍吸干。无菌
ice @ 4℃ overnight and actually become more competent. They can also be left @ 4℃ overnight in the second 10mL TE/ LiOAc wash. 6．Transformation reaction: 50uL competne yeast 10uL SS DNA @ 5mg/mL (dissolved, boiled, aliquoted and stored @ -20℃). 2-5uL DAN (mini-prep) 250uL 40% PEG/1×TE/LiOAc (200uL 50% PEG, 25uL 10×TE, 25uL10×LiOAc). 7．Incubate 30min @ 30℃. 8．Heat shock 15min @ 42℃. 9． *Spin 25 sec in ufuge. 10．Resuspend in 250uL 1×TE (no LiOAc). 11．Plate to selective media. Allow three days for transformants to arise. *G418 Transformations as follows: A．Spin 25sec in ufuge. B．Wash in 200-500uL H2O, spin another 25sec. C．Resuspend in 200-500uL H2O. D．Add to 2mL liquid YPD in a 15mL conical and grow all day to overnight @ 30℃. E．Spin 5min @ 3000rpm in table-top centrifuge. F．Wash in 1-2mL H2O, spin again. G．Resuspend in 200-400uL TE and plate to YPD +G418.
Prepared freshly and filter sterilized 6、0.7M NaCl 溶液 Autoclave 用于溶解酶
7、酶液的配制：用 0.7M NaCl 溶液溶解酶，酶液浓度为 7.5mg/ml，过滤除菌，现配现用
其他实验器材
50ml 离心管 1.5ml EP 管 1ml, 200ul, 20ul 枪头 滤纸 擦镜纸 过滤器 过滤头 镊子
PH6.5 (W/NaOH) to 1L For solid media add 15g agar Autoclave Ⅰ*、20ⅹNitrate Salts：
120g
NaNO3
10.4g
KCl
10.4g
MgSO4•7H2O (5.2 if anhydrous)
30.4g
KH2PO4
Add ddH2O to 1L Autoclave
NaCl 溶液轻轻冲洗 1-2 次，去残渣，收集滤液于 50ml 离心管中。 7、离心，3000rpm，4℃，10min。 8、小心弃上清，加 10-20ml1ⅹSTC 悬浮，用剪去尖端的枪头轻轻吹打 离心，
3000rpm 4℃ 10min。 9、重复步骤 8 两次。 10、加适量（约 300ul）1ⅹSTC 悬浮，计数，使原生质体终浓度为 108 个/ml，分装
Ⅱ*、1000ⅹTrace Elements:
Store at 4℃
80ml
ddH2O
2.2g
ZnSO4•7H2O
1.1g
源自文库H3BO3
0.5g
MnCl2•4H2O
0.5g
FeSO4•7H2O
0.17g
CoCl2•6H2O
0.16g
CuSO4•5H2O
0.15g
Na2MnO4•2H2O
5g
Na4EDTA or 5.5gNa4EDTA•2H2O
1．From single colony, start 5 mL overnight in YPD. 2．In the morning seed a 50 mL culture with 0.5 to 1.0 mL saturated overnight. Grow to
OD=0.4-0.6 (usually 8 am to around 2:30 pm is sufficient ). 3．Spin 5min @ 3000rpm (sorvall table top is fine ). 4．Resuspend / wash ×2 in 10 mL 1×TE/LiOAc. Spin 5min @ 3000rpm. 5．Resuspend in 250uL 1×TE/LiOAc and use 50 uL for transformation. These can be left on
Add ddH2O to 100ml Store at 4℃
Ⅲ*、Vitamin Solution
0.01g
Biotin
0.01g
Pyridoxin
0.01g
Thiamine
0.01g
Riboflavin
0.01g
PABA(P aminobenzoic acid)
0.01g
Nicotinic Acid
静置时间不宜过长，PTC 对原生质体会有毒性。加好后去解冻 TB3 固体培养基 3、把原生质体加到 10ml 左右熔化后冷却至 45℃-55℃的 TB3 固体培养基中（含 50ug/ml Amp），轻轻混匀后倒入培养皿中 28℃黑暗培养 24h 培养基温度越低越好，解冻后放于 45℃水浴中防止其凝固；培养基的量也可多加， 分倒于多个皿中。 4、往培养皿中再倒入 10ml 含 300ug/ml HygromycinB 的 TB3 固体培养基（最好含 50ug/ml Amp） 5、28℃下黑暗培养 7-10d 后挑出转化子，一般 5d 后即可看出转化是否成功 6、在含 300ug/ml HygromycinB 的 TB3 固体培养基上再次筛选验证转化子。 ◆注意事项： 原生质体非常脆弱，操作过程中动作要轻 溶液配制要精确，需用ddH2O配制 器皿要绝对干净
为 150ul/管。立即转化或保存于-70℃。最好立即转化，一般不保存。 二．转化（Transformation）
1、将 2ug DNA（5-10ul）加于 150ul 原生质体中，轻轻混匀，室温静置 25min DNA 浓度需足够大，且要干净
2、分 2-3 次加 1mlPTC，轻轻混匀，室温静置 25min
CaCl2
4、TB3
Autoclave
3g
Yeast Extract
3g
Casamina Acids
20%
Sucrose
Add ddH2O to 1L for solid media add agar to 0.65-0.75% Autoclave 5、PTC
60% （w/v）
PEG4000 in 1ⅹSTC
水冲洗步骤可有可无。 5、将菌丝置于盛有 10-20ml 酶液（含 50ug/ml Amp）的 50ml 离心管中酶解。离心
管平躺，30℃ 60rpm 2-3h。 酶解过程中应吸取菌液镜检，检查原生质体是否释放；酶液需现配现用，PH 值很
关键，需用低浓度（0.1M）的 NaOH 调 PH 至 5.8。 * 以下步骤于 4℃下完成，0.7M NaCl 溶液,1ⅹSTC 先放于 4℃预冷。 6、取出酶解液，加少许 0.7M NaCl 溶液，轻轻摇晃，倒于三层擦镜纸过滤，用 0.7M
植物病理学高级实验技术指导
（植物病理学专业研究生使用）
南京农业大学植保学院植物病理学系 2010-09
植物病理学实验技术
第一部分 真菌学实验技术
实验一 稻瘟病菌转化（Transformation of Magnaporthe grisea）
一．原生质体的制备（Protoplasting） 1、活化菌株，接种菌丝块(2mm×2mm)于 CM 平板上生长 6d 左右，菌落直径约 3cm，
漏斗 烧杯 玻璃棒 培养皿等。以上器材全需湿热灭菌处理，全部操作于超净工作台中完成。
实验二 酵母转化（Yeast Transformation）
Solutions: 10×TE=100mM Tris·HCl pH7.5, 10mM EDTA 10×LiOAc=1M LiOAc 50%PEG 4000 (only good for about 6 months)
在不同的细菌中，感受态的形成机制也有所不同。对于枯草芽孢杆菌来说，自然感 受态是对数生长后期在一种二元信号转导系统的调节下形成的，需要一系列相关基因的 表达。按照这些基因的功能和表达时间的先后，它们被分为早期感受态基因和晚期感受 态基因。其中早期基因主要对感受态的形成起调节作用，并进一步促使晚期感受态基因 的表达。而后者主要负责细胞对外源DNA的吸附、吸收和重组。在枯草芽孢杆菌中如果 感受态形成基因缺失则会导致转化的困难。 二、实验材料： 受体菌株：Bacillus subtilis 168 待转化质粒：pAD43-25（Cm+,Amp+）(此质粒是穿梭质粒，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 中都可以复制,并能组成性表达GFP) 培养基：LB液体和固体培养基 其他材料：（以下物品均需灭菌） 1.5mL 离心管，枪头，空试管，涂布棒，培养皿等 试剂： 1，SPI－A Salts Solution：（100 ml Solution）
Add ddH2O to 100ml Store in a dark glass bottle at 4℃
2、5ⅹ YEG
5g
Yeast Extract
10g
D-Glucose
3、1ⅹ STC
Add ddH2O to 1L Autoclave
20%
Sucrose
50mM
Tris•Cl PH 8.0
50mM
第二部分 细菌学实验技术
实验一 枯草杆菌化学感受态制备及转化方法
自然条件下，很多细菌均可以从外界环境中摄取外源DNA，使之获得新的遗传变异， 从而更好的适应环境条件。当然，枯草芽孢杆菌也不例外。在分子生物学高速发展的今 天，通过人工的方法也可以使细菌获得从外界摄取外源DNA的能力，从而使受体菌获得 新的遗传性状，这一过程叫做转化（Transformation）。枯草芽孢杆菌的转化有多种方 法，比如化学转化，电转化，原生质体转化等，但目前比较常用的是化学转化方法。 一、原理：
三．所需试剂及培养基（Reagents and media）
1、CM 培养基： 50ml
20ⅹNitrate Salts*
1ml
Trace Elements*
10g
D-Glucose
2g
Peptone
1g
Yeast Extract
1g
Casamina Acids
1ml
Vitamin Solution*
0.2％ (NH4)2SO4 1.4% K2HPO4·3H2O 0.6% KH2PO4 0.1% Trisodium Citrate Dihydrate (柠檬酸三钠) pH=7.2 121 ℃灭菌20 min 2，SPI－B Salts Solution：（100 ml Solution） 5% MgSO4·7H2O （5 g MgSO4·7H2O加双蒸水定容到100 ml） 121 ℃灭菌20 min 3，100× CAYE Solution：（100 ml Solution） 2％ Casamino acid 2 g 10％ Yeast Extract 10 g 121 ℃灭菌20 min 4，50％Glucose（葡萄糖）（单配，50％W，即125g/250ml 溶液，115℃灭菌20 min） 5，50 mM CaCl2 （单配，121℃灭菌20 min）[100 ml: 0.073 g 的CaCl2·2H20（MW:147.02）
菌株不宜太老，最好不要超过 12 d。 2、切取直径约 3cm 的菌落，尽量切碎，置于约 100ml CM/5ⅹYEG 的液体培养基
中（含 50ug/ml Amp），28℃，150rpm，过夜。 3、往瓶中再加 50ml 左右液体培养基，最好含 Amp，28℃ 150rpm 过夜视菌丝
生长情况，如果菌丝生长缓慢，可再加培养基，延长培养时间，但要尽量防止其变黑。 4、收集菌丝，用四层擦镜纸过滤，无菌水冲洗两遍，用吸水纸将水稍吸干。无菌
ice @ 4℃ overnight and actually become more competent. They can also be left @ 4℃ overnight in the second 10mL TE/ LiOAc wash. 6．Transformation reaction: 50uL competne yeast 10uL SS DNA @ 5mg/mL (dissolved, boiled, aliquoted and stored @ -20℃). 2-5uL DAN (mini-prep) 250uL 40% PEG/1×TE/LiOAc (200uL 50% PEG, 25uL 10×TE, 25uL10×LiOAc). 7．Incubate 30min @ 30℃. 8．Heat shock 15min @ 42℃. 9． *Spin 25 sec in ufuge. 10．Resuspend in 250uL 1×TE (no LiOAc). 11．Plate to selective media. Allow three days for transformants to arise. *G418 Transformations as follows: A．Spin 25sec in ufuge. B．Wash in 200-500uL H2O, spin another 25sec. C．Resuspend in 200-500uL H2O. D．Add to 2mL liquid YPD in a 15mL conical and grow all day to overnight @ 30℃. E．Spin 5min @ 3000rpm in table-top centrifuge. F．Wash in 1-2mL H2O, spin again. G．Resuspend in 200-400uL TE and plate to YPD +G418.
Prepared freshly and filter sterilized 6、0.7M NaCl 溶液 Autoclave 用于溶解酶
7、酶液的配制：用 0.7M NaCl 溶液溶解酶，酶液浓度为 7.5mg/ml，过滤除菌，现配现用
其他实验器材
50ml 离心管 1.5ml EP 管 1ml, 200ul, 20ul 枪头 滤纸 擦镜纸 过滤器 过滤头 镊子
PH6.5 (W/NaOH) to 1L For solid media add 15g agar Autoclave Ⅰ*、20ⅹNitrate Salts：
120g
NaNO3
10.4g
KCl
10.4g
MgSO4•7H2O (5.2 if anhydrous)
30.4g
KH2PO4
Add ddH2O to 1L Autoclave
NaCl 溶液轻轻冲洗 1-2 次，去残渣，收集滤液于 50ml 离心管中。 7、离心，3000rpm，4℃，10min。 8、小心弃上清，加 10-20ml1ⅹSTC 悬浮，用剪去尖端的枪头轻轻吹打 离心，
3000rpm 4℃ 10min。 9、重复步骤 8 两次。 10、加适量（约 300ul）1ⅹSTC 悬浮，计数，使原生质体终浓度为 108 个/ml，分装
Ⅱ*、1000ⅹTrace Elements:
Store at 4℃
80ml
ddH2O
2.2g
ZnSO4•7H2O
1.1g
源自文库H3BO3
0.5g
MnCl2•4H2O
0.5g
FeSO4•7H2O
0.17g
CoCl2•6H2O
0.16g
CuSO4•5H2O
0.15g
Na2MnO4•2H2O
5g
Na4EDTA or 5.5gNa4EDTA•2H2O