分子诊断技术平台的进展及展望

撑 Echo33
(10):1873
Archive virology, 2014 ， DOI 10.1007
技 术 服 全国分子和血清学流行病 J. Infection 2011，62(1):107
务 和 支 学调查，大规模SNP分析 BMC Infect Dis, 2010， 10:178
撑
Inflam. Bowel Dis 2011,1 7(12):2472 PLOS One , 2013, 8(1): e55197
PLOS One, 2013 (accepted)
现 场 初 手足口，H1N1，H7N9流感，J Virol Met 2010,167(2), 214
步筛查 诺 如 病 毒 , HPV ， HIV ， J Virol Met 2011,175:283
HCV,MERS, Ebola
J. Clin. Microbiol 2011, 49(10）3545 PLOS One ,2012,7(12): e52486
中心实验室科研方向简介
1 未知病原检测技术平台 2 高通量自动化工作站技术平台 3 多病原、症候群检测技术平台 4 现场检测技术平台
检测/监测/鉴定技术平台
现场检测技术 ---- LAMP, IMSA 多病原检/监测技术 --- GeXP, Qiaxcel, RPM 未知病原鉴定 --- NGS，VIDISCA, RPM 自动化检测---- Liquid handling system 生物信息学支持---- VIP软件
J. Clin. Microbiol 2012, 50(2):288 J.Med Virol. 2012, 84:957 J. Clin. Microbiol. 2012, 50(7) ：
2384
BMC Infect Dis, 2012,12:189
BMC Microbiology 2013, 13:58
血清学鉴 定
PCR 和 DNA测序
NGS测序
检测技术概述 ➢ 形态学（电镜） ➢ 组织学（细胞培养） ➢ 免疫学（ELISA,Western Blot,
IF,NT,HI） ➢ 分子生物学（PCR,RT-PCR,qPCR,mPCR,
Microarray,Sequencing……）
传统检测方法的局限性
LAMP技术特点
特异性强:
2对引物配对6个区域或3对引物配对8个区域
灵敏度高： 10-100 copies
设备要求低: 不需要PCR仪器，65℃ 水浴（等温） 检测快速： 1小时
操作简单： 一步法（单管） 结果判定方便：颜色（肉眼观察颜色变化和沉淀）
吸光值（半定量，650nm比色）
普通琼脂糖电泳
多病原检测 省级 /监测
现场检测 地市级
生物信息学 国家级 软 件 DS2 ， VIP
高 通 量 呼 吸道(9+7)， 手 足口 ， J Virol Met. 168 (2010) 255–258
检 测 和 流感，腹泻，HPV分型， Adv. in Virology 2011: 129134
症 候 群 SNP，耐药,转基因，脑炎 监测
分子诊断技术平台的进展及展望
内容
➢ 病原体检测技术概述 ➢ 病原体核酸检测技术概述 ➢ 病原体核酸检测新技术应用 ➢ 核酸检测新技术存在问题及发展
背景
治疗 ➢ 近10年新发传染病绝大多数是病毒引起
背景
感染人 296种
37属
动物病毒 1917种 204属
病毒与亚病毒 6819种 408属
背景
病毒分离 培养
病毒检测/监测/签定技术平台及生物信息学
技术平台 定位 功能 实际应用
相关英文文章（中文文章略）
未知病原鉴 国家级 定
自动化检测 国家级
技 术 服 Tembusu Virus
in J. Virol. 2012, 86(6):3406
务 和 支 ducks, China, Echo 33 Emerging Infect Dis, 2011. 17
➢ 胶体金 （灵敏度 窗口期） ➢ ELISA （灵敏度 窗口期） ➢ PCR/RT-PCR （通量 未知病原） ➢ Real-time PCR （通量 未知病原) ➢ 巣式PCR/RT-PCR (污染，电泳）
核酸扩增检测技术概述
来自百度文库
➢ 核酸扩增技术是一种常规生物技术，是分子生物学的基础研究方法。 作为主流检测技术被广泛应用于实验室、医院。 ➢ 核酸扩增技术可分为变温扩增技术和等温扩增技术。
Adv. in Infect Dis, 2012, 2, 110-118
技 术 服 表位分析，抗原抗体相互 J Virol Met 181 (2012) 182– 187
务 和 支 作用
Biomed Environ Sci, 2012; 25(1): 98-
撑
103
核酸检测新技术
➢ LAMP/IMSA/RPA ➢ Multiplex PCR ➢ Nested PCR (一步法） ➢ Digital PCR ➢ 自动化检测 ➢ 再测序芯片 ➢ PCR 阵列 ➢ 二代测序（NGS） ➢ POCT（现场检测）
浊度（浊度仪，实时监测，半定量）
Realtime PCR 与 LAMP 特点比较
Realtime PCR
实时荧光定量PCR仪
VS
仪器要求
LAMP
水浴、热块、PCR仪、浊度仪
实时荧光定量PCR仪
实验结果
电泳、浊度、颜色指示剂、肉眼观察
～2小时 反应时间 ～1小时
核酸检测新技术
➢ LAMP/IMSA/RPA ➢ Multiplex PCR ➢ Nested PCR (一步法） ➢ Digital PCR ➢ 自动化检测 ➢ 再测序芯片 ➢ PCR 阵列 ➢ 二代测序（NGS） ➢ POCT（现场检测）
核酸检测技术发展趋势 ➢ 未知病原 ➢ 多病原 ➢ 高通量 ➢ 自动化 ➢ 现场技术 (POCT)
变温扩增
PCR Realtime PCR
RT PCR Nested PCR Multiplex PCR Digital PCR
等温扩增 TMA/NASBA SMART HDA SDA/NDA RCA/MDA LAMP/IMSA RPA
基于T7 Promoter 基于解旋酶 基于链置换活性的
DNA 聚合酶 链置换和重组酶