乙型肝炎病毒标志物的检测.

间接法——测抗体
步骤一
将抗原HBsAg吸附于载体表面（厂家 已经完成）
步骤二
•原理：将待测血清加入， 温育，血清中如有HBsAb， 则抗原抗体结合 操作： •阳性血清，阴性血清，待 检血清各加1孔，每孔 50ul(1滴)
步骤三
原理：加入酶复合物， (HBsAg-HRP),酶复合物 与表面抗体结合 操作： 加酶复合物1滴,混匀, 置 37℃温育30分钟 倒出液体,洗涤5次，拍 干。
HBcAg： 一般血清学方法检测不到 抗HBc： 提示病毒在体内复制增殖。 HBeAg： 病毒复制和血清有传染性的标志 抗-HBe：传染性低、预后好的征象。 HBV DNA：病毒复制和有传染性最直接的证据
结果分析
HBsAg HBeAg
+ + + + + + -
抗-HBs
+ -
抗-HBe
+ +
存在于三型颗粒中 是HBV感染的主要标志，见于急性、慢性、 携带者 抗-HBs，保护性抗体（中和抗体），标志 着机体对HBV有免疫力，见于恢复期、既往 感染者或接种疫苗后
（2）核心抗原（HBcAg）与核心抗体（抗HBc） 内衣壳，仅存在于感染的肝细胞核内，不
易在血液中检出
抗原性强，刺激机体先产生IgM，后产生 IgG，后者可在血清中存在多年 抗HBc无中和作用，高效价抗HBc –IgM 提示病毒在体内复制增殖。
实验十二
乙型肝炎病毒标志物的检测
实验目的和要求
1、熟悉ELISA（ enzyme-linked immunosorbent assay ）的原理及操作方法
2、掌握乙型病毒标志物的临床意义
（一）基本原理
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗 原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时， 把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按 不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的 方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开， 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定 的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反 应的深浅进行定性或定量分析。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗 原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标 抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中 受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物 成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该 抗原的定性或定量。
2、间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为 利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的 受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固 相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与 抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗 涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他 免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相 抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
抗HBc + -/+ + +
结果分析
肝功能正常为无症状携带者 肝功能异常为乙肝患者 同上，传染性强 急性或慢性乙型肝炎（传染 性强，“大三阳”） 乙肝恢复期 感染过HBV或“窗口期” 急性感染趋向恢复（“小三 阳”）
-
-
+
-
-
既往感染或接种过疫苗
（三）实验方法
1、双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤 如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗 体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段 时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合， 形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体 结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤 后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的 量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶 标羊抗人IgG抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检 抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
（3）e抗原（HBeAg）与e抗体（抗-HBe） 可溶性蛋白，游离存在于血液中 它的消长与DNA聚合酶及Dane颗粒出现的时 间一致，为病毒复制和血清有强传染性的标志。 抗-HBe有一定保护作用，是传染性低、预后好 的征象。
乙肝五项的临床意义
HBsAg:
感染的主要标志
抗-HBs：对HBV有免疫力
（一）基本原理
③用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体 复合物与其他物质分开，最后结合在固相载 体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的 比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化 变为有色产物，产物的量与标本中受检物质 的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进 行定性或定量分析。
（二）实验试剂
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体， ②酶标记的抗原或抗体， ③酶作用的底物。 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具 备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
步骤四
加入酶的底物，酶与 底物反应，显色 操作： 每孔加显色液A液,B 液，各1滴，37℃温 育15分钟，使充分显 色。
步骤五
终止反应：每孔加终止液50μl（一滴） 肉眼观察或上机比色
（四）应用
百度文库——乙肝病毒标志物的检测
1、乙肝病毒的形态结构
大球形颗粒
（ Dane颗粒，有感染性的完整颗粒）
HBV DNA
DNAP
HBcAg （内衣壳蛋白） HBsAg
（外衣壳蛋白）
小球形颗粒
过剩的衣壳
（ HBsAg）
管形颗粒
2、HBV的抗原组成
表面抗原HBsAg：外衣壳
核心抗原HBcAg：内衣壳，仅感染的肝细胞核内
e抗原HBeAg：自肝细胞分泌而存在于血清中
3、HBV的抗原抗体系统
（1）表面抗原（HBsAg）与表面抗体（抗-HBs）