生物技术大实验部分操作程序-易

生物技术大实验操作指南

注意事项

1、工作服穿戴，禁止吃东西和大声喧哗和串门聊天。

2、用电、气安全注意事项。

3、节约用水，安全用水，有毒、害废水的正确处理。

4、实验室、台卫生，最后离开实验室的同学检查水电门窗。

5、实验报告，正确记录原始数据，分析结果得出合理的结论。

实验一鸡输卵管总RNA提取（溶菌酶基因的提取）

一、原理：组织细胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加Trizol快速匀浆碾磨，加

一定体积的氯仿振荡，离心，取水相，加等体积的异戊醇（或无水乙醇）沉淀，75%乙醇洗涤，晾干，无RNase的ddH2O溶解。

二、试剂与设备：TotalRNAExtractor（Trizol）或RNAsimple Total RNA Kit，

氯仿，异戊醇，无水乙醇，ddH2O Free RNase。研钵，玻璃匀浆器，16000转低温冷冻离心机。

三、步骤：

1、新鲜鸡输卵管膨大部，50mg，预冷的研钵中剪碎，加1ml Trizol冰浴中匀浆，

RT 5-10 Min。

2、加200ul 氯仿，振荡15 Sec，RT 3 Min。

3、4℃ 12000rpm，离心10Min，吸取上层水相，转入新的离心管。

4、加500ul 异戊醇柔和混匀，RT沉淀30Min,离心同上，留取沉淀。

5、加1ml 75%乙醇洗涤沉淀2次，勿剧烈振荡，离心同上，收取沉淀，RT晾干

3-5Min。

6、50ul ddH2O Free RNase 溶解沉淀。

7、检测RNA纯度与浓度。

四、结果

五、讨论

实验二溶菌酶基因第一链cDNA合成

一、原理：mRNA经M-MuLV催化，以Oligo dT为引物，将mRNA反转

录合成cDNA，此cDNA为单链。

二、试剂与设备：M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，恒温水浴锅，掌上离

心机。

三、步骤：

1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：

总RNA 或Poly(A)+ RNA或特异性RNA Xμg

Oligo dT (0.5μg/μL) (20 pmol) 1μL

RNase free ddH2O 定容至12μL

2. 轻轻混匀后离心3~5 s，反应混合物在65℃温浴5 min后，冰浴30 s，然后

离心3~5 s。

3．将试管冰浴，再加入如下组分：

5×Reaction Buffer 4μL

RNase Inhibitor ( 20 U/μL) 1μL

dNTP Mix(10 mmol/L) 2μL

M-MuLV RT（200 U/μL）1μL

注：若5×Reaction Buffer出现白色结晶，需37℃温浴数分钟至白色结晶完全溶解，震荡混匀。

4．轻轻混匀后离心3~5 s。

5．在PCR 仪上按下列条件进行反转录反应cDNA 合成42℃ 30-60 min

6.终止反应95℃ 5 min(酶失活)，处理后，置于冰上放置或-20℃保存。

* M-MuLV RT酶最后加。

四、结果

五、讨论

实验三鸡溶菌酶基因的PCR扩增

一、原理：利用耐热Taq酶（一种DNA聚合酶），以四种dNTP为底物，

在引物的诱导下，经过变性、退火、延伸三步反应，体外合成DNA双

链分子。

二、试剂与设备：2X PCR Plus MasterMix，ddH2O，模板，上、下游引物，

掌上离心机，PCR仪。

三、步骤：

1、反应体系如下：

模板DNA （第一链cDNA）X ul（＜1ug）

引物1（10 uM） 1 ul

引物2（10 uM） 1 ul

2X PCR Plus MasterMix 12.5ul

ddH2O 10.5-X ul

Total 25 ul

如果体系变化，可按此比例添减。

2、PCR反应条件：

95℃ 5 Min

95℃ 30Sec

56错误！未找到引用源。30Sec 30 Cycles

72错误！未找到引用源。30Sec

72错误！未找到引用源。10Min

3、结果检验取3-8ul，PCR产物，1%Agarose 电泳。（切下目的条带-20错

误！未找到引用源。保存）

四、结果

五、讨论

实验四PCR产物的回收纯化

一、原理：PCR产物经过琼脂糖电泳分离，切取含目的产物的胶条，用胶回

收试剂盒回收。

二、试剂与设备：DNA胶回收试剂盒，TBE电泳Buffer，琼脂糖，Goldview

染料，2000 DNA Ladder，无水乙醇，TE或ddH2O，恒温水浴锅，水平电泳仪，高速冷冻离心机等。

三、步骤：

1、通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术

刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5 ml离心管中，称重。

2、根据胶块的重量和浓度，按每100 mg琼脂糖（如胶块不足100 mg则用水补充

至100 mg）加300- 600 μl的比例加入Binding Buffer II。

3、将离心管置于55℃水浴5-10 min，间或混匀，直至胶块完全溶化。

4、当目的片段< 500 bp时，加入所使用的Binding Buffer II 1/3体积的异丙醇，混