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基因功能研究方法
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1
随着生物学研究在分子水平上的不断深入 和推进，越来越多的新基因得以成功克隆，对 新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基 因组时代功能基因组学的重要研究内容。
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1. 微阵列分析
微阵列(microarray) 是近年来发展起来 的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因 组表达谱、DNA 序列多态性、致病基因或疾病 相关基因的一项研究基因功能的新技术。它包 括cDNA微阵列(cDNA microarray)和DNA芯片。
的信号 • 软件进行进行图象分析和数据处理
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2. 基因转导技术
基因转导是将目的基因转入某一细胞中,然后观察 该细胞生物学行为的变化,从而了解该基因的功能。这 是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法 之一。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表 达两方面因素的影响。主要方法有物理的、化学的和 生物的方法。
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3
原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
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微阵列法分析过程
首先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 作为 模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录 合成cDNA。再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交, 然后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知 道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同 样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达 水平低。
1>.逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基因 容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白 表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低， 且其随机整合有引起“插入性突变”的可能。
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2>.腺病毒(adenovirus, Adv): 为近年肝细胞肝癌基因 治疗中报告最多的一种病毒载体。装载外源基因容量 最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入 突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引 起宿主免疫反应而使转染效率下降。
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物理方法 1>. DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但
注入量有限, 能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转 化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。
2>. 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压 发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从 而提高肿瘤细胞的转化率。
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• 喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样 需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在1cm2面积上可喷射10000个点。
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• 原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷 酸原位光刻DNA合成技术。
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芯片的制作
• 目前常用的基因芯片制作方法：
•
接触点样法、喷黑法、原位合成法。
• 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结 构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
• 采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个 光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’ 端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合 成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长， 在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。
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信号检测与结果分析
• 激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 • 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点
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3.2 反义RNA技术
反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
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化学方法 1>.脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原
性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有 一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一
种有价值的体内基因转移方法。
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2>.受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受 体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转 移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝 细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。
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3.1 反义寡核苷酸技术
反义核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体 表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过 碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA 的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细 胞的生长、分化等。根据结合部位的不同分为反义DNA （asDNA）、反义RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribo zyme）。
优点:靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶 酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂， 表达效率低下。利用腺病毒与内吞小泡相融合而将其 破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。
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生物学方法 (主要通过构建病毒载体来完成) 病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术因其转
染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。
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3. 反义技术
反义技术是根据碱基互补原理,利用人工或生物合 成的特异互补的DNA 或RNA 片段(或其修饰产物) 来抑 制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术(An tisense oligonuclerotides , ASON)、反义RNA技术 和核酶(Ribozyme)技术。
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随着生物学研究在分子水平上的不断深入 和推进，越来越多的新基因得以成功克隆，对 新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基 因组时代功能基因组学的重要研究内容。
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1. 微阵列分析
微阵列(microarray) 是近年来发展起来 的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因 组表达谱、DNA 序列多态性、致病基因或疾病 相关基因的一项研究基因功能的新技术。它包 括cDNA微阵列(cDNA microarray)和DNA芯片。
的信号 • 软件进行进行图象分析和数据处理
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2. 基因转导技术
基因转导是将目的基因转入某一细胞中,然后观察 该细胞生物学行为的变化,从而了解该基因的功能。这 是目前应用最多、技术最成熟的研究基因功能的方法 之一。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表 达两方面因素的影响。主要方法有物理的、化学的和 生物的方法。
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原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
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微阵列法分析过程
首先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 作为 模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录 合成cDNA。再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交, 然后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知 道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同 样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达 水平低。
1>.逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基因 容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白 表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低， 且其随机整合有引起“插入性突变”的可能。
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2>.腺病毒(adenovirus, Adv): 为近年肝细胞肝癌基因 治疗中报告最多的一种病毒载体。装载外源基因容量 最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入 突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引 起宿主免疫反应而使转染效率下降。
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物理方法 1>. DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但
注入量有限, 能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转 化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。
2>. 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压 发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从 而提高肿瘤细胞的转化率。
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• 喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样 需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在1cm2面积上可喷射10000个点。
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• 原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷 酸原位光刻DNA合成技术。
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芯片的制作
• 目前常用的基因芯片制作方法：
•
接触点样法、喷黑法、原位合成法。
• 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结 构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
• 采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个 光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’ 端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合 成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长， 在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。
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信号检测与结果分析
• 激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 • 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点
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3.2 反义RNA技术
反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
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化学方法 1>.脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原
性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有 一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一
种有价值的体内基因转移方法。
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2>.受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受 体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转 移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝 细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。
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3.1 反义寡核苷酸技术
反义核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体 表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过 碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA 的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细 胞的生长、分化等。根据结合部位的不同分为反义DNA （asDNA）、反义RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribo zyme）。
优点:靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶 酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂， 表达效率低下。利用腺病毒与内吞小泡相融合而将其 破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。
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生物学方法 (主要通过构建病毒载体来完成) 病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术因其转
染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。
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3. 反义技术
反义技术是根据碱基互补原理,利用人工或生物合 成的特异互补的DNA 或RNA 片段(或其修饰产物) 来抑 制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术(An tisense oligonuclerotides , ASON)、反义RNA技术 和核酶(Ribozyme)技术。