过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响
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第２ ７卷
第 ５期
天 津科 技大学学报
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｉｎｉ ｉｅｓ ｙｏ ｃｅ ｃ ＆ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｏ ｒ ａ ａ ｊｎＵｎｖｒｉ ｆ ｉ ｅ ｏＴ ｔ Ｓ ｎ ｅｈ ｏｏ ｙ
Ｖ １２ Ｎｏ ５ ０ ｌ．７ ．
０ ｃ ． ０１ ｔ２ ２
２１ ０ ２年 １ ０月
ＧＣＧＣ ＧＡＩ △ Ｃ Ｉ △ＧＴ ＡＡＴ ＧＡＣＡ ＡＧ ＡＣ ＡＡＣＧ Ｃ
中间体 ， 谷氨 酸棒杆 菌 中 Ｌ 蛋氨 酸和 卜 异 亮 氨酸 在 一 均不 同程 度地 阻遏 ｈ ｒ ｔｒ 操纵 子 的转 录 ， 断天 ｏ— Ｂ ｎ ｈ 阻 冬 氨 酸半 醛 进入 Ｌ 异 亮 氨酸 生 物合 成途 径 ， 而 在 一 从
Ｔａｊ ｎｖｒｉ ｆ ｃ ｎ ｅ ｅｈ ｏｏ ｙ Ｔａｊ ０ ４ ７ Ｃ ｉａ ｉ ｉ Ｕ ｉｅｓｙｏ ｉ ｃ ＆Ｔ ｃｎ ｌｇ ． ｉ ｉ ３ ０ ５ ， ｈｎ ） ｎｎ ｔ Ｓｅ ｎｎ
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｓ ｒ ｃ ：Ｈｏ ｓ ｒｎ ｅ ｙ ｒ ｔ ｓ ａ ｋ ｙ ｅ ｚ ｍｅ ｏ ｉｏ ｅ ｃｎ ｙ ｔ ｅ ｉ ｒ ｃ ｓ ，ｓｅ ｃ ｄ ｄ ｂ ｅｈ ｒ ｅ ｅ ｉ ｏ ｙ ｍｏ ｅ ｉ ｅ ｄ ｈ ｄ ａ ａ ｅ， ｅ ｎ ｙ ｆ Ｌ—ｓ ｌｕ ｉ ｅ ｓ ｎ ｈ ｓｓｐ ｏ ｅ ｓ ｉ ｎ ｏ ｅ ｙ ｔ ｏｎ ｇ ｎ ｎ Ｃ ｒ — ｈ
收 稿 日期 ：２ １— ３ ０ ；修 回 日期 ：２ １ — ４ ０ ０２０— ６ ０２０— ７
棒 杆 菌 、 糖 发 酵短 杆 菌及 大肠 杆 菌选 育 而来 ． 乳 工 业 化生 产 中广泛 应用 的 Ｌ 异 亮氨 酸高 产菌 多为 经过 一
基金项 目：国家发改委高技术产业化专项项 目 作者简介 ：徐庆 阳 （ ９ Ｏ ），男 ，安徽萧县人 ，助理研究员 ；通信作者 ：陈 １８ 一 宁 ，教授 ，ｎ ｇ ｈ ｕｔ ｄ ． ． ｉ ｃ ＠ｔｓｅｕ ｎ ｎ ． ｃ
关键酶 ， 本研 究通过在 Ｌ 异亮氨 酸生产菌 ｃ ｇｕａ ｉｕ Ｌ 中过表 达高丝氨 酸脱 水酶 ， ＿ ｌｔｍ ｃｍ ＹＩＷ 考察过表达 高丝氨酸脱水
酶 对 发 酵 异 亮氨 酸产 量 的 影 响 ． Ｌ 异 亮氨 酸 生 产 菌 ｃ ｌｔｍｉ ｒ Ｌ 基 因组 为模 板 克 隆 ｈ ｍ 基 因 ， ｈ ｍ 以 一 ｇｕ ａ ｃ ｎＹＩｗ ｕ ｏ 将 ｏ
作 用 ．目前 ， 用微 生物 生产 Ｌ 异亮 氨酸 的方 法主 ¨ 利 一
要 为 直 接 发 酵 法 ， ＿ 亮 氨 酸 产 生 菌 大 多 由谷 氨 酸 Ｌ异
广泛应用于 医药 、 品及其调 味剂 、 食 动物饲料 、 化妆
品 的制造 ， 尤其 是 在 医学研 究 和治疗 中有十 分重 要 的
６３８％． ．
关键词 ：
异亮氨酸 ；高丝氨酸脱水酶 ；过表达 ；谷 氨酸棒杆 菌 文献标志码 ：Ａ 文章编 号 ：１７ —５ ０ ２ １） ５００ —６ ６ ２６ １ （０２ ０—０ １ ０
中图分类号 ：Ｑ８２ １
Ｅｆｅ ｔ ｆｏ ｖ ｒ ｘ ｅ ｓ０ ｆＨ ｏ ｏ ｅ ｉ ｈｙ ａ ａ ｅｏ Ｌ—ｓ ｌｕｃｎｅ ｆ ｃ ｓｏ ｅ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｍ ｓ ｒｎｅＤｅ ｄｒ ｔ ｓ ｎ Ｉｏ ｅ ｉ Ｐｒ ｄｕｃ ｉ ｎ ｉ ｒ ｏ ｔｏ ｎ Ｃｏ ｙｎｅ ａ ｔｒｕ ｕ ａ ｉ ｕ ｂ ｃｅ ｉ ｍ ｇｌ ｔ ｍ ｃ ｍ
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一
１． ｐ ． １ ＸＭＪ９ｈ ｒ表 达载体 的 构建 ４ １．ｏ ｎ 以 Ｃ ｌｔ ｃｍＹＩｗ 染 色体 Ｄ ｇｕａ ｕ Ｌ ｍｉ ＮＡ 为模 板 ， 使
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一
Ｔ ． ， 线处 为 Ｘ ａ Ｉ Ｃ３ 划 ｂ 酶切位 点 ） 为引 物 Ｐ Ｒ扩 增 出 Ｃ
Ｘ Ｑｉｇ ａ ｇ Ｕ ｉ ａ ，ＸＩ ｉｉ ，Ｃ Ｅ Ｎｉｇ Ｕ ｎ ｙ ｎ ，Ｓ Ｎ Ｊａ ｉ ｋ Ｅ Ｘ ｘａ ｎ Ｈ Ｎ ｎ
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基 因与表 达载 体 ｐ ＸＭＪ９连 接构 建 出重 组质 粒 ｐ ＭＪ９ｈ ｍ， 转入 Ｃ ｇｕａｎｃｍ Ｙ Ｌ 构建 Ｃ ｌｔｍｃ ｍ １ Ｘ １一ｏ 再 ｌｔｒｉ Ｉｗ ｕ ．ｇｕａ ｉｕ Ｙ Ｌ （Ｘ １．ｏ ） 通过 ５ 罐发 酵研 究重组质粒对 工程 菌的生长、 Ｉｗ ｐ ＭＪ９ｈ ｍ ． Ｌ 耗糖 、 ＿ Ｌ 异亮氨酸产量及副产物积 累等方面的 影响． 结果显 示， 重组酶 的表达使 菌株对 Ｌ 苏氨酸的抗反馈 抑制作用得到加强． ＿ 最终 Ｌ 异亮氨酸和 Ｌ 蛋氨酸积 累量 一 一 分别为 ３ ．ｇＬ 和 ２８ｇＬ 分别较 出发 菌株提 高 ７ ６５ ／ ． ／， ％和 ３ ％， ３ 同时 Ｌ 赖氨 酸合 成量仅 为 ２１ ／ 较 出发菌株降低 了 ＿ ．ｇＬ，
ｅ ｐ ｅｓｄ ｉ ｇｕａ ｃ ｍ Ｌ （ ＸＭ Ｊ ９ ｈ ｒ）ｔａｎｗａ ｃ ｓ ｅ ｓｔ ｅｔ ｒ ｏ ｉｅｉｈｂｔ ｎ Ｃｏ ａｅ ｔ ｅ ｘ ｒ ｓｅ ｅ ｌｔｍｉｕ ＹＩ Ｗ ｐ ｎ １ 一ｏ ｓｒｉ ｓｍｕ ｈｌ ｓｓｎ ｉｖ ｔ ｅ ｎｎ ｉｉｏ ． ｍｐ ｒｄｗｉ ｔ ｎ ｅ ｉ ｏｈ ｎ ｉ ｈｈ
ｏ ｉｉａ ｔａｎ．ｈ ｉｌｓｏ Ｌ— ｏｅ ｃｎ ｎ ｄＬ ｍｅｈｏ ｉｅｂ ｒ ｎ ｌ ｒｉ ｔｅｙｅｄ ｆ ｉ ｌｕ ｉｅａ ｇ ｓ ｓ — ｔｉｎｎ ｙｕｓ ｇＣ ｇ ｕａ ｉｕ ＹＩ Ｗ （ ＸＭＪ ９ ｈ ｍ） ｒ ６５ｇＬ ａ ｄ ｉ ｎ ｌｔｒ ｃ ｒ ｎ ｎ Ｌ ｐ １ －ｏ ｗｅｅ３ ． ／ ｎ
ｎ ｂ ｃ ｅ ｉ ｍ ｌ ｔ ｍｉ ｕ Ｔ ｅｅ ｆ ｃ ｆ ｖ ｒ ｘ ｒ ｓ ｅ ｏ ｓ ｒｎ ｅ ｙ ｒ ｔ ｓ ｎ ｅ ａ ｔ ｒｕ ｇ ｕ ａ ｃ ｍ． ｈ ｆｅ ｔ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｈ ｍｏ ｅ ｉ ｅ ｄ ｈ ｄ ａａ ｅｉ ｇ ｕ ａ ｃ ｍ ＬＷ ｎ ｔ ｅｐ ｏ ｕ ｔ ｎ ｏ ｏ ｏ ｌ ｔ ｍｉｕ ＹＩ ｏ ｒ ｄ ｃｉ ｆ ｈ ｏ
过表 达 ｈ ｍ 基 因对 谷 氨 酸 棒 杆 菌 发 酵 Ｌ 异 亮氨 酸 的影 响 ｏ 一
徐庆 阳，孙家凯 ，谢希 贤，陈 宁
（ 工业发酵微生物教育部重点实验室 ，天津科技大学生物工程学 院，天津 ３ ０ ５ ） ０ ４ ７
摘
要 ：谷 氨 酸 棒 杆 菌 （ ｏｙ ｅ ａｔｒ ｍ ｇｕａ ｃｍ） ｈ ｍ 基 因编 码 的 高 丝氨 酸脱 水酶 为 Ｌ 异 亮氨 酸 合 成 过 程 的 Ｃ ｒｎｂ ｃｅｉ ｌｔｍｉ ｕ ｕ 中 ｏ －
６３． ． ８
Ｋｅ ｒ ｓ Ｌ ｉｏ ｅ ｃｎ ； ｈ ｍｏ ｅ ｉ ｅｄ ｈ ｄ ａａ ｅ ｏ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｙ ｗｏ ｄ ： —ｓ ｌｕ ｉ ｅ ｏ ｓ ｒｎ ｅ ｙ ｒ ｔ ｓ ； ｖ ｒ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ； Ｃ ｌ ｔ ｍｉ ｕ ｇ ｕ ａ ｃ ｍ
Ｌ 异 亮 氨 酸 （— ｏｅｃ ｅ属 于 分 支 链 氨 基 酸 ， ＿ Ｌｉ ｌｕｉ ） ｓ ｎ 是 人 体 必需 的八 种氨 基 酸之 一 ， 具有 多 种 生理 功 能 ，
ｐ ａｍｉ ｓｔｅ ａ ｓｏｍ ｅ ｔ ｇｕａ ｃ ｍ Ｌ ｏｃ ｎ ｔ ｃ ｅ ｏ ｉｅ ｇ ｕａ ｃ ｒ ＬＷ （ＸＭ Ｊ ９ ｈ ｒ） Ｔｈ ｌｓ ｄｗａ ｎｔ ｎ ｆｒ ｄｉ ｏＣ ｌｔｍｉｕ ＹＩ Ｗ ｔ ｏ ｓ ｕ ｔ ｃ ｍｂｎ ｄｅ ｌ ｔｍｉｕｎＹＩ ｈ ｒ ｎ ｒ ｒ ｐ １ 一ｏ ． ｅ ｎ
Ｅ ． １ ） 谷 氨 酸 棒 杆 菌 （ ｏｙ ｅ ａ ｔ ｉｍ ｇｕ Ｃ１１ ． 是 ．３ Ｃ ｒｎ ｂ ｃ ｒ ｌ． ｅｕ
１３ 培养基 － Ｌ 培 养 基 、 子培 养 基 及 发酵 培 养 基 ， 参 考 Ｂ 种 见
文献 【］ ７．
１ ． 方法 ４
ｔ ｉ ｍ 中 Ｌ 异亮氨酸 的合成途径 中的关键酶之 ａ ｃ ） ｍ ｕ ＿ 由 ｈ ｒ 基因编码 ， ｏ ｎ 受苏氨酸的反馈抑制和蛋氨酸 的反 馈 阻遏 ． Ｌ 异 亮 氨 酸生 物 合 成过 程 中 ， 在 一 天冬 氨 酸半 醛是 合成 赖氨 酸 、 苏氨 酸和蛋 氨 酸 的共 同代谢
・
２・
天津科 技大 学学报 第 ２ 卷 第 ５ ７ 期
Ｒ ＡＤ 公 司 ．
传 统诱 变 育种 获得 的谷氨 酸棒 杆菌 ， 其副 生杂 酸 比 但
较 多 ， 其 是赖 氨 酸 、 氨 酸等 ， 大 了 后期 提 取 获 尤 丙 加
得 高纯 度 Ｌ 异亮 氨酸 的难度 ｌ． 一 ３ ］ 高 丝 氨 酸 脱 水 酶 （ｏ ｓｒ ｅ ｅｙｒｇｎｓ ｈ ｍｏｅｉ ｄｈ ｄｏｅａｅ。 ｎ
第 ５期
天 津科 技大学学报
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Ｖ １２ Ｎｏ ５ ０ ｌ．７ ．
０ ｃ ． ０１ ｔ２ ２
２１ ０ ２年 １ ０月
ＧＣＧＣ ＧＡＩ △ Ｃ Ｉ △ＧＴ ＡＡＴ ＧＡＣＡ ＡＧ ＡＣ ＡＡＣＧ Ｃ
中间体 ， 谷氨 酸棒杆 菌 中 Ｌ 蛋氨 酸和 卜 异 亮 氨酸 在 一 均不 同程 度地 阻遏 ｈ ｒ ｔｒ 操纵 子 的转 录 ， 断天 ｏ— Ｂ ｎ ｈ 阻 冬 氨 酸半 醛 进入 Ｌ 异 亮 氨酸 生 物合 成途 径 ， 而 在 一 从
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收 稿 日期 ：２ １— ３ ０ ；修 回 日期 ：２ １ — ４ ０ ０２０— ６ ０２０— ７
棒 杆 菌 、 糖 发 酵短 杆 菌及 大肠 杆 菌选 育 而来 ． 乳 工 业 化生 产 中广泛 应用 的 Ｌ 异 亮氨 酸高 产菌 多为 经过 一
基金项 目：国家发改委高技术产业化专项项 目 作者简介 ：徐庆 阳 （ ９ Ｏ ），男 ，安徽萧县人 ，助理研究员 ；通信作者 ：陈 １８ 一 宁 ，教授 ，ｎ ｇ ｈ ｕｔ ｄ ． ． ｉ ｃ ＠ｔｓｅｕ ｎ ｎ ． ｃ
关键酶 ， 本研 究通过在 Ｌ 异亮氨 酸生产菌 ｃ ｇｕａ ｉｕ Ｌ 中过表 达高丝氨 酸脱 水酶 ， ＿ ｌｔｍ ｃｍ ＹＩＷ 考察过表达 高丝氨酸脱水
酶 对 发 酵 异 亮氨 酸产 量 的 影 响 ． Ｌ 异 亮氨 酸 生 产 菌 ｃ ｌｔｍｉ ｒ Ｌ 基 因组 为模 板 克 隆 ｈ ｍ 基 因 ， ｈ ｍ 以 一 ｇｕ ａ ｃ ｎＹＩｗ ｕ ｏ 将 ｏ
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广泛应用于 医药 、 品及其调 味剂 、 食 动物饲料 、 化妆
品 的制造 ， 尤其 是 在 医学研 究 和治疗 中有十 分重 要 的
６３８％． ．
关键词 ：
异亮氨酸 ；高丝氨酸脱水酶 ；过表达 ；谷 氨酸棒杆 菌 文献标志码 ：Ａ 文章编 号 ：１７ —５ ０ ２ １） ５００ —６ ６ ２６ １ （０２ ０—０ １ ０
中图分类号 ：Ｑ８２ １
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过表 达 ｈ ｍ 基 因对 谷 氨 酸 棒 杆 菌 发 酵 Ｌ 异 亮氨 酸 的影 响 ｏ 一
徐庆 阳，孙家凯 ，谢希 贤，陈 宁
（ 工业发酵微生物教育部重点实验室 ，天津科技大学生物工程学 院，天津 ３ ０ ５ ） ０ ４ ７
摘
要 ：谷 氨 酸 棒 杆 菌 （ ｏｙ ｅ ａｔｒ ｍ ｇｕａ ｃｍ） ｈ ｍ 基 因编 码 的 高 丝氨 酸脱 水酶 为 Ｌ 异 亮氨 酸 合 成 过 程 的 Ｃ ｒｎｂ ｃｅｉ ｌｔｍｉ ｕ ｕ 中 ｏ －
６３． ． ８
Ｋｅ ｒ ｓ Ｌ ｉｏ ｅ ｃｎ ； ｈ ｍｏ ｅ ｉ ｅｄ ｈ ｄ ａａ ｅ ｏ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｙ ｗｏ ｄ ： —ｓ ｌｕ ｉ ｅ ｏ ｓ ｒｎ ｅ ｙ ｒ ｔ ｓ ； ｖ ｒ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ； Ｃ ｌ ｔ ｍｉ ｕ ｇ ｕ ａ ｃ ｍ
Ｌ 异 亮 氨 酸 （— ｏｅｃ ｅ属 于 分 支 链 氨 基 酸 ， ＿ Ｌｉ ｌｕｉ ） ｓ ｎ 是 人 体 必需 的八 种氨 基 酸之 一 ， 具有 多 种 生理 功 能 ，
ｐ ａｍｉ ｓｔｅ ａ ｓｏｍ ｅ ｔ ｇｕａ ｃ ｍ Ｌ ｏｃ ｎ ｔ ｃ ｅ ｏ ｉｅ ｇ ｕａ ｃ ｒ ＬＷ （ＸＭ Ｊ ９ ｈ ｒ） Ｔｈ ｌｓ ｄｗａ ｎｔ ｎ ｆｒ ｄｉ ｏＣ ｌｔｍｉｕ ＹＩ Ｗ ｔ ｏ ｓ ｕ ｔ ｃ ｍｂｎ ｄｅ ｌ ｔｍｉｕｎＹＩ ｈ ｒ ｎ ｒ ｒ ｐ １ 一ｏ ． ｅ ｎ
Ｅ ． １ ） 谷 氨 酸 棒 杆 菌 （ ｏｙ ｅ ａ ｔ ｉｍ ｇｕ Ｃ１１ ． 是 ．３ Ｃ ｒｎ ｂ ｃ ｒ ｌ． ｅｕ
１３ 培养基 － Ｌ 培 养 基 、 子培 养 基 及 发酵 培 养 基 ， 参 考 Ｂ 种 见
文献 【］ ７．
１ ． 方法 ４
ｔ ｉ ｍ 中 Ｌ 异亮氨酸 的合成途径 中的关键酶之 ａ ｃ ） ｍ ｕ ＿ 由 ｈ ｒ 基因编码 ， ｏ ｎ 受苏氨酸的反馈抑制和蛋氨酸 的反 馈 阻遏 ． Ｌ 异 亮 氨 酸生 物 合 成过 程 中 ， 在 一 天冬 氨 酸半 醛是 合成 赖氨 酸 、 苏氨 酸和蛋 氨 酸 的共 同代谢
・
２・
天津科 技大 学学报 第 ２ 卷 第 ５ ７ 期
Ｒ ＡＤ 公 司 ．
传 统诱 变 育种 获得 的谷氨 酸棒 杆菌 ， 其副 生杂 酸 比 但
较 多 ， 其 是赖 氨 酸 、 氨 酸等 ， 大 了 后期 提 取 获 尤 丙 加
得 高纯 度 Ｌ 异亮 氨酸 的难度 ｌ． 一 ３ ］ 高 丝 氨 酸 脱 水 酶 （ｏ ｓｒ ｅ ｅｙｒｇｎｓ ｈ ｍｏｅｉ ｄｈ ｄｏｅａｅ。 ｎ