HBV、HCV高精度核酸检测技术的临床意义

临床对HBV/HCV检测技术的需求
国内行业指导原则
•国家SFDA技术审评中心《HBV DNA定量试剂技术审
评指导原则》中指出：
HBV DNA最低检测限应 ≤30IU/ml
临床对HBV/HCV检测技术的需求
国内现状
• 国产很多乙肝PCR试剂的灵敏度为500IU/ml至1000IU/ml之 间，丙肝试剂的灵敏度为在1000IU/ml以上。
PCR技术简介
PCR技术简介
病原学检测常用的实验室技术
☆ 细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验 ☆ 血清学、免疫学诊断技术
☆ 电镜技术
☆ 分子生物学诊断技术——PCR
PCR技术简介
多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶
可提高初始治疗效果
可预防或延缓核苷类似物耐药变异
耐药变异出现后联合治疗可预防多重耐药变异出现
基因芯片
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 HBV分子生物学检测方法及临床意义
检测种类 检测方法 临床意义
鉴别HBV病毒A-H8个基因型 基因分型检测 同上 各型与临床转归及抗病毒治疗反应不同
前C区及核心区启
PCR技术简介
核裂变链式反应
“链式反应”改变世界
PCR技术简介
PCR技术的诞生
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
•1971：Khorana等提出在体外经DNA变性、引物 杂交,再用DNA聚合酶延伸DNA的设想。 •1983：Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实 现。 •1988：耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 •1993：Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
“2008年美国肝病协会CHB防治指南”：持久消除HBV是乙
肝的治疗终点，HBV DNA病毒载量尽可能小于或等于10 IU/ ml。
临床对HBV/HCV检测技术的需求
“欧洲肝病研究学会EASL2010年指南”指出：采用荧光实时PCR 方法检测HBV DNA时，其灵敏度要小于或等于10-15 IU/ ml。
卫生部要求 常规煮沸法 圣湘磁珠法 罗氏磁珠法 美国肝病协会建议
1000IU/ml 500IU/ml 10IU/ml 12IU/ml 10IU/ml
1000IU/ml-1E8IU/ml 500IU/ml-1E8IU/ml 20IU/ml-2E9IU/ml 30IU/ml-1.1E8IU/ml 手工操作 手工操作 需要罗氏全自动 核酸提取工作站 推荐罗氏HBV试 剂
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 常用DNA类标本处理方法
煮沸法 一 裂解方法 分离方法 步骤 1. 2. 煮沸 离心 煮沸裂解 离心，去除 大分子的抑 制物 取上清扩增 1. 2. 二 煮沸 离心 加入沉淀剂 离心弃上清，浓 缩标本并去除小 分子抑制物 煮沸裂解 离心，取上清扩 增，去除大分子 抑制物。 较差 与核酸相似分子量的 混合物 手工 1. 2. 3. 4. 5. 柱提取 化学裂解 亲和吸附 化学裂解 过柱吸附 洗涤 洗脱 取洗脱液扩增 1. 2. 3. 4. 5. 磁珠法 化学裂解 吸附或杂交 化学裂解 加磁珠吸附 洗涤 洗脱 取洗脱液扩增
40 36.2
30
病 人 (%)
23.5 20 14.9 12.2 9.8 10 1.4 4.5 5.9
3.6
1.3
0
< 300
300999 10009999 10,00099,999
•实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物 的增加,直观地看到反应的对数期 •降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的
特异性
•增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 •结果分析更加快捷方便,无需跑胶
PCR技术简介
PCR的应用
有传染性
可能有传 染性
有免 疫力
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
乙肝病毒的检测方法
☆ 免疫学检测 ☆ 生物化学检测 ☆ 组织学检测 ☆ 分子生物学检测 ☆ 基因芯片
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
HBV分子生物学检测
☆ HBV-DNA ☆ 基因耐药突变检测 ☆ 基因分型
☆ HBVcccDNA
荧光定量 PCR（real-time PCR)
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行 分析,计算待测样品的初始模板量。 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。
PCR技术简介
荧光定量实时PCR与普通PCR的比较
• 从病毒性肝炎的早期诊断及适时确定治疗终点的临床需求 看，现有的国产PCR试剂需要提高检测灵敏度。
Part Ⅳ HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义
HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义
13年随访累积肝癌的发生率[1] (N = 3653)
50
13年随访累积肝硬化 的发生率[2] (N = 3582)
PCR技术简介
Kary B. Mullis（1944－）
http://www.karymullis.com
The New York Times as "highly original and significant, virtually dividing biology into the two epochs of before P.C.R. and after P.C.R."
操作简化 操作简化 操作简化
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 （圣湘）磁珠法HBV产品与国内外主流产品的比较
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 圣湘磁珠法HCV产品与国内外主流产品的比较
25 IU/ml
பைடு நூலகம்
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
不同方法的HBV DNA检测下限以及不同标准要求
比较项目 检测下限 线性范围 备注
PCR技术简介
PCR原理：实质就是体外基因复制技术
PCR技术简介
30次循环后靶序列扩增的数量
10亿
PCR技术简介
PCR技术分类
常规PCR
在PCR结束后对终点产物进行分析。
巢式PCR 多重PCR PCR结合限制性长度多态性分析（PCR-RFLP） PCR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（PCR-ASO） PCR结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE） PCR结合的单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
☆ 国内大部分检测试剂灵敏度≥1000Copies/ml，
特异性、准确性等方 也存在着严重缺陷，远远 不能满足临床检测和用药监控的需求，这也是国 内HCV研究进展缓慢的重要原因之一。
Part Ⅲ
临床对HBV/HCV检测技术的需求
临床对HBV/HCV检测技术的需求
PCR-RFLP
基因芯片 同上 耐药检测 可提高初始治疗效果 可预防或延缓核苷类似物耐药变异 耐药变异出现后联合治疗可预防多重耐药变异出现
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 目前国内外乙肝主流基因诊断技术比较
•
除个别公司产品外，国内的检测技术在方法学、灵敏度以及准确性方面一般都远远落后于发达国家
优点 不足
核酸纯度高，无需高速离心
操作繁琐，设备和人员操作要求高。 需频繁更换离心管，核酸丢失率高，特异性 低病毒载量标本检出率低。 差。
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 高灵敏度的磁珠核酸纯化方法的比较
比较项目 更换EP管 裂 解 洗 涤 核酸洗脱 圣湘磁珠法 无需更换 1管裂解液、室温 1次完成 无需洗脱 常规磁珠法 更换2-3次 多管裂解液（加热） 洗涤 3-4次 加热 洗脱 备注 操作简化
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
急性乙型肝炎各项生理指标
4-12 周
1-2 周 2周－ 3月
3 － 6月 血清学 转换期
潜伏 期
潜伏 后期
急性 急性期 早期
康复期
痊愈
标 志 物 相 对 浓 度
Anti-HBc HBsAg Anti-HBc IgM DNA HBeAg Anti-HBe Anti-HBs
HCV的感染模型
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
丙肝病毒的检测方法
☆ 血清生化学检测
☆
☆
HCV抗体检测
HCV核心抗原检测
☆
HCV RNA 检测
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
HCV分子生物学检测方法及临床意义
检测种类 检测方法 RNA-cDNA-PCR 定性检测 血筛（输血、生物制品） HCV-RNA检测 直接RNA扩增（NASBA） 定量检测 实时荧光定量PCR PCR产物直接测序 焦磷酸测序 克隆测序 基因分型检测 liPA(可分5-10%混合型) 各型与临床转归及抗病毒治疗反应不同 鉴别HBV病毒A-H8个基因型 初始治疗依据 治疗检测、疗效评估、方案调整 预后评估（基线水平、RNA变化） 临床意义 确诊HCV感染（特别是移植、血透、HIV合并）
肝炎病毒PCR检测技术国内现状及最新进展
暨HBV/HCV高精度核酸检测技术的临床意义
主要内容
Part Part Part Part
Ⅰ
荧光定量PCR技术简介 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 临床对HBV/HCV检测技术的需求 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Part Ⅰ
1、目的基因的克隆：
PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。
2、基因的体外突变：
可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析 的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的 检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
动子（BCP） 突变检测 同上
与疾病预后有关，肝硬化及原发肝癌中均高
发生核苷酸类似物耐药突变的危险因素
序列特异引物-跨reDNA双 cccDNA检测
缺口PCR
病毒复制中，双螺旋切口补齐，行程cccDNA，它是
HBV前基因组RNA的转录模板，对HBV复制及感染
有重要意义
Southern印迹杂交
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
☆ HBV前C及核心启动子变异
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 HBV分子生物学检测方法及临床意义
检测种类 检测方法 临床意义
实时荧光定量PCR
bDNA HBV-DNA检测 竞争PCR 杂交捕获
确诊HBV感染
病始治疗方案确定 治疗过程动态监测 抗病毒治疗选择及监测 预后评估
PCR产物直接测序 焦磷酸测序 基因耐药突变检 测 克隆测序 反向线性杂交 PCR-RFLP
3.
3. 4.
抗干扰能力 提取物组分 自动化程度
差 较小分子量的混 合物 手工
好 全核酸 手工或自动
最好 特定病原的核酸 半自动或全自动
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 常用RNA类标本处理方法
酚-氯仿提取 原理 步骤 液相萃取 1、标本加裂解液加氯仿混匀，静置 数分钟 2、高速低温离心10-15分钟 3、取上清加异丙醇 4、高速低温离心10-15分钟 5、弃上清，酒精洗涤 6、高速低温离心5-10分钟 7、弃上清，晾干 8、加水，水浴，取样上机检测 最经典提取方法 硅胶吸附 1、标本加裂解液加去抑制剂等混匀，热裂 解10分钟。 2、加入无水乙醇沉淀核酸 3、整体移入柱，离心甩干或负压抽干 4、加入洗涤液1，离心甩干或负压抽干 5、加入洗涤液2，离心甩干或负压抽干 6、加入洗脱液，高速离心1分钟 7、取洗脱下来液体上机检测 柱提取
临床对HBV/HCV检测技术的需求
“欧洲肝病研究学会EASL2011指南”还指出：丙肝患者治疗的
终点是HCV
RNA病毒载量低于50 IU/ ml。
临床对HBV/HCV检测技术的需求
研究表明国产PCR试剂的灵敏度很难达到上述要求
五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较,中华传染病杂志，2009年 第3期 ——吴星,黄维金, 周诚 ,庄辉 等(中国药品生物制品检定所,北京大学医学部)
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平
5、基因突变分析：
利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。
Part Ⅱ
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
HBV/HCV核酸检测技术现状及进展
乙型肝炎检测标志物
☆ HBsAg, 抗-HBs,
☆ HBeAG,抗-HBe, ☆抗-HBc（IgG,IgM）, ☆ HBV-DNA