植物蛋白质的提取和测定实验
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植物蛋白质含量的测定
一、原理
查询资料,得知玉米蛋白质含量较高。再经Tris-HCl缓冲液研磨、离心后,得可溶性蛋白质于上清液中,将沉淀用碱水解则得到非可溶性蛋白质的提取液,将提取液与卡马斯亮蓝溶液反应呈蓝色,在595nm处有最大吸收峰。在一定范围内,蛋白质含量与反应液在595nm 波光的吸收度呈正比,由此可求出蛋白质的含量
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料:玉米粒
(二)仪器设备:
分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵;离心管;刻度移液管;微量滴定管;试管等(三)试剂:
100μg/ml牛血清标准蛋白质溶液;0.15mol/L NaCl; 1mol/LNaOH;50mmol/L Tris-HCl提取液、卡马斯亮蓝溶液
三、实验步骤
(一)标准曲线的绘制
编号 0 1 2 3 4 5
标准蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Tris-HCl提取液(ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
卡马斯亮蓝溶液(ml) 5 5 5 5 5 5
每管牛血清蛋白含量(ml) 0 20 40 60 80 100
加入表中的试剂,摇匀,室温放置4分钟,以不加标准蛋白的0号管为空白,在595nm波长处测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
(二)样品的测定
称取鲜样0.5g,加提取液6ml,研磨成匀浆后,在10000r/min,4℃条件下离心20min,上清液即为可溶性蛋白质提取液。沉淀加3ml1mol/L NaOH溶液,在90℃恒温水浴锅中加热20min,在4000r/min,4℃条件下离心10min,上清液为非可溶性蛋白质提取液。取上清液各0.1ml,分别加入Tris-HCl提取液0.9ml,然后再分别加入卡马斯亮蓝溶液5ml,摇匀,于595nm 波长处测定吸光值。根据吸光度查标准曲线,求出样品中的蛋白质含量。
四、结果计算:
样品中蛋白的含量(μg/g)=查标准曲线值(μg)×提取液总体积(ml)/(样品鲜重(g)×测定时加样量(ml))
粗蛋白量(%)=蛋白氮含量×6.2