常规病理切片制作中常见的问题及处理方法

·病理诊断·常规病理切片制作中常见的问题及处理方法

山西省万荣县人民医院（044200）陈俊艳

常规病理切片最基本的技术就是石蜡切片及苏木素-伊红（HE）染色，是临床外科病理最基本、最普遍的形态学检验技术。病理切片制作的优劣、完美与否将直接影响病理诊断的准确性。其制作过程较繁琐，在实际工作中常会遇到各种原因引起的质量不佳，甚至会造成不良后果，每一个细小环节出问题，都会给后面的步骤造成影响。现结合实际工作中遇到的一些问题和解决方法，谈谈提高病理切片质量的几点体会，工作中不仅要严格按照病理技术操作规范标准规范化操作，对各种潜在影响严加注意，更需要在实际工作中不断总结经验教训、积极探索，提高工作效率，改进制片质量。

1流程步骤

1.1标本接收：依申请单认真核对后登记编号。标本袋（瓶）上姓名一定要标记清楚，严防搞错。

1.2固定：（1）标本良好、充分的固定是制片最关键、最基础的第一关。固定的目的是组织保持在活体内原有形态，使细胞内各种化学成分得以定为不可溶性，沉淀、凝固细胞内物质。固定剂可与蛋白质交联，使之变性、组织硬化、结构固定，固定后可与染料结合，增强着色能力，使得显微镜下易于清晰地观察组织细胞内微细结构。如固定不当，对后续工作所造成的不良影响是无法补救的，标本离体后就及时固定，越新鲜越好。固定液首选10%甲醛中性缓冲液，量为固定组织体积的4~10倍，固定时间要18~24h。小标本可适当缩短3~ 6h；大标本一定要按要求切开固定，对当日手术标本不要急于取材，待固定24h后再取。尤其是要做免疫组织化学（IHC）的固定更应注意（固定时间过长造成某些组织抗原性丢失及甲醛色素沉着）。（2）常见问题：①减少和去除切片中甲醛颗粒：甲醛饱和液偏酸，影响细胞核着色，特别是固定久后，易析出沉淀，切片上呈细小黑褐色或黄黑色颗粒物，影响观察。去除方法：切片脱蜡后浓氨水1mL+75%乙醇溶液200mL溶液中处理30min，如还有可以再延长时间，后用流水冲洗。10%中性甲醛固定液应用效果相对较好，不要长时间固定，可以减少和消除甲醛颗粒。②防止组织固定不良：组织固定不均匀，中央区组织固定不良，质地软，不仅取材时切面不整，还会影响脱水、透明、浸蜡、可剖开后继续固定。

1.3取材：①标本经充分固定后即可取材，取材合格与否将直接影响脱水、透明：取材刀剪要锋利，操作规范、薄厚一致、形状规整。小标本要用滤纸（纱布块）包紧，严防遗失，不要离开操作台面。取材要取完一个清洗台面后再取下一个，以防污染。大标本取材要大小适中，组织面通常为

2.0cm×1.5cm，厚度不超过2~3mm。太厚不易脱水；太薄脱水后组织又容易变形、变脆。取材时注意线结应剔除。骨及含钙组织脱钙要充分，取材时可用镊子弯曲120°可弹回说明脱钙完全，为避免骨组织切片过度红染，可流水冲洗除酸；也可将组织放入2%氢氧化钠（NaOH）溶液处理10min再用流水冲洗。②常见问题：取材组织厚薄不均：取材时要刀快、手稳，切面平整。

1.4脱水：（1）要建立严格脱水剂更换制度：脱水是影响切片质量的重要环节，要保证脱水彻底而又不过度。保证梯度酒精的浓度和容量，且要及时更换。大小标本尽量分开脱水，合理搭配低浓度和高浓度酒精的脱水时间，组织在高浓度酒精内时间长会发硬、发脆。淋巴结、脂肪组织应在低浓度酒精内时间长一些；结缔组织多的应在高浓度酒精内时间长一些；眼球标本要单独处理，低浓度酒精内延长8~12h。（2）常见问题：①脱水不彻底，因无法置换组织内水分，浸蜡不完全，切片中出现松软空洞，摊片易散开，染色时易脱片，着色不良，蜡块缩水。可试着再浸蜡。②脱水过度，组织变硬、变脆，切片易碎裂。一旦发生，可浸入香柏油中软化，再用二甲苯洗去浸蜡。

1.5透明：目前还是用二甲苯，必须要把握好透明时间和温度，室温为宜，30~60min为宜。温度过高，时间过长均会使组织变脆。

1.6浸蜡：（1）组织浸蜡良好利于切片。合适浸蜡温度为55~ 60℃，所用石蜡熔点为56℃，第一道浸蜡30min，第二道浸蜡60min，第三道浸蜡90min以上。第一道蜡缸内蜡要及时更换，否则蜡内二甲苯含量高时，不易浸蜡。浸蜡前尽量使组织内二甲苯挥发。温度过高及浸蜡时间过长都会造成组织块脆硬，不易切片。（2）常见问题：浸蜡不足导致切片困难，补救措施：①可再浸蜡。②用一端钝圆的钢锯条圆钝端1cm处加热后紧贴组织面上，可见小气泡溢出，反复几次，小气泡消失，修补好蜡块，冷冻后重切。

1.7包埋：提倡使用包埋盒、包埋机，以使包埋蜡块规范化。通常采用最大面包埋：①小块多粒组织应尽量放在一起，保证在同一平面上；②数块小组织呈线状包埋，不要杂乱无章，否则易造成切片不全（有的切完有的还未切出），一般胃肠镜小组织以窄面朝下；③管腔、囊壁组织要立埋；④有特殊要求的不能随意放置，如皮肤、有乳头的组织；⑤包埋时注意有无缝线、纸絮并剔除；⑥如果组织边缘四角翘起或扭曲不平，应用包埋镊压平；⑦包埋用蜡要干净、致密。包埋时蜡缸温度不能超过70℃，以防石蜡挥发，污染环境；⑧刚包埋好的蜡块不能立即冷冻。

1.8切片：切片时要精心，尤要注意多个小组织在一个蜡块上时要切全。切片机放在平稳的操作台面上，高度合适。切片刀、蜡块安装牢固，有关螺丝拧紧。切片刀锋利，用力均匀。被切的蜡块要足够冰冻，可放入冰箱冷藏30min，切片4~6μm。放置蜡块时要注意包埋方向、组织层次，如表皮、含浆膜、包膜的组织，把较难切的组织放在上面；纤维和肌肉走向与切片刀

平行。如组织发脆可边向蜡块吹气边切。防毛笔丝进入刀口。每切一个蜡块都应该将切片刀和刀架上碎屑清理干净，避免相互污染。

1.9展片、捞片：水温控制在50℃，将切片在水中展开，有皱褶可用眼科镊展平，温度低展不开，温度高会使切片化掉，组织上细胞间隙分散，给诊断造成假象。室温低时捞片可将载玻片放入水中片刻，防褶而致脱片。胃肠镜等小组织要摆放有序，一般6~9片。

1.10烤片：温度控制在70℃左右，时间不少于30min，温度过高、时间过长会使切片发生“焦糊”、组织收缩、折光增强，影响诊断。温度低、时间短、脱蜡不净易造成脱片。

1.11染色：（1）染色过程中首先要保证各种试剂浓度、体积，且不能有沉淀。切片先脱蜡彻底，苏木素一般染5~10min，1%盐酸酒精分化是关键，分化程度要严格控制。深染色，长分化。分化返蓝流水冲洗10min以上，可用温水返蓝，切片定要透明，二甲苯取出后立即封片也很关键，中性树胶要适量适中，不要溢胶。染色过程不要让切片干燥，封盖玻片时要从一边开始放下，以免产生气泡。如有气泡可用小镊子按住盖玻片一端挤出气泡。（2）常见问题：①切片片状蓝染，示切片脱蜡不彻底。②切片入二甲苯时有云雾状出现，示切片尚未干燥，即刻取出烘干。③切片入水后有云雾状出现，示清洗二甲苯的酒精浓度不够，应更换酒精。④切片从酒精移入二甲苯

时产生白色云雾状，示脱水不彻底，须更换酒精、二甲苯。⑤伊红不易着染时可加入数滴冰醋酸酸化。但也不能过多，否则核质红染。⑥封片时注意避免口、鼻呼出气体接触树胶或室内湿度大使切片云雾状，故动作要快。⑦干封会产生细小黑点及细胞会收缩。⑧染色后发现脱片，可能：A玻片不洁，有油质；附贴时水温低、切片不平、附贴不紧；烤片时间不够或温度较低；组织块脱水不全，浸蜡不透造成切片厚；组织过干过硬；组织块本身易脱落，如血块；水冲洗太猛。

1.12归档：（1）切片制好后放置一段时间待树胶干后才能归档。否则易粘片，归档切片应放置于干燥避光处，避免褪色。（2）常见问题：切片易褪色，可能：①脱水、透明等步骤操作不当；②没有使用中性封固剂；③切片曝晒；④盖玻片可能较小。2讨论

通过实际工作经验总结：标本及时固定、取材大小适中、脱水彻底透明、浸蜡浸透组织、包埋放平放整、切片既全又薄、染色清晰分明、封片干净大方，要想提高工作质量，不仅要规范化操作，还要有高度责任心，严谨工作作风，在实际工作中不断摸索，总结经验，认真分析可能影响切片质量的各种因素，减少制作中的人为现象，认真对待每一个步骤环节，因为病理切片质量至关重要。

（收稿日期：2012-03-23）

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