肾小管上皮细胞培养

超净台的规范使用

1.打开无菌工作台及净化室的紫外灯，消毒30min以上。

2.进入净化室前先关闭紫外灯，打开超净台风机，等待30min以上，以排尽臭氧。

3.穿好隔离衣，戴好口罩，帽子。

4.风淋2分钟。

5.75%酒精喷手上手套消毒

6.再超净台内的整个过程必须一直点燃着酒精灯；超净台内应避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。

7.打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。

8.水平式风机的超净台，应使瓶口斜置，应尽量避免瓶口敞开直立。

9.同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。

10.漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。

11.操作完毕后恢复工作台面，关闭风机。

2012.06.29

小鼠肾小管上皮细胞培养

基础培养液配置：

完全培养基的配置：基础培养基+胎牛血清+抗生素和链霉素

1.取两个灭菌平皿，两个都加适量基础培养基

2.试验小鼠最好禁食12小时，自由饮水。在细胞间外颈椎脱臼致死，75%酒精中

浸泡即可带进细胞间，75%酒精浸泡5min左右取出

3.以下步骤须在超净台操作。用镊子将小鼠拿出后放于干净托盘在超净台上（小鼠均腹部

向上以便肾脏取出）

4.用镊子和剪刀剪开肚皮，用另一镊子和剪刀取出肾脏放入盛有基础培养基的培养皿

5.用两个弯镊子剖肾筋膜，之后放于80目细胞筛（细胞筛浸有基础培养基的培养皿中），

肾脏用培养基浸湿后直接在细胞筛上研磨，直至磨至近白色即可弃去此筛

6.用150目细胞筛进行过滤（因肾小管段在范围为80—150目内所以150目筛上的是我们

所要的），此筛下放一平皿用来接过滤液即为废液（过滤时用移液枪操作）

7.另取一新培养皿，将150细胞筛反过来放在培养皿上，用移液枪吸取基础培养液将肾小

管段冲洗至培养皿中，尽量少用培养液

8.弃去细胞筛，将有肾小管段的培养液倒入15ml离心管1000r/min离心4min

9.弃上清，加等量胶原酶（胶原蛋白水解酶(Collagenase)胶原酶仅对细胞间质有消化作用

而对上皮细胞影响不大），37度温浴15min

10.1100r离心5min，弃上清

11.两只小鼠加36ml完全培养基，用移液器将肾小管段尽可能的吹散

12.细胞瓶中放5ml培养且细胞瓶盖不要拧紧以便细胞呼吸，六孔板中放2ml培养，24孔板

放100微升培养为佳。这是原代细胞培养。

2012.06.30下午

13.细胞传培养：

从对侧倒掉培养液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精灯。

如果细胞不干净可用PBS清洗(冲洗)，加入适量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，然后让其停止消化。

细胞培养所用试管洗涤方法

洗衣粉洗---冲净20遍---超生两次（每次2分钟）---自来水冲洗--烘干---泡酸8h----自来水冲洗20遍----纯水冲洗干净---烘干---包装高压