第6讲克隆基因的检测与鉴定

2. Biblioteka Baidu择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密 码；（不破坏肽）。
-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。
第二节 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。 （只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌 株的突变型缺陷。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆中 分离质粒，电泳、比较 其分子量。
分子量 Marker
重 组 克 载体 隆
二、酶切电泳筛选法
1. 原理：
根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱， 选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶 切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的 结果。
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素 抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
乳糖
半乳糖 +
-半乳糖苷酶
X-gal
半乳糖 +
1. 原理：
葡萄糖
5-溴-4-氯靛蓝 深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互 补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。 1. 原理
抗原——抗体凝集反应。 2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入 基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时， 就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
只有带有插入片断的重组载体才能与探 针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选
结果
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以 直接找出阳性菌落。
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。 在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时 候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳 定。电镜下可见一种R-环形结构。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选过程
A
A
T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法
1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。
2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
孔底
（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗
（3）二抗结合
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗 掉。二抗只识别一抗。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。
二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
酶连（conjugation）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底
3. 选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素 抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平 板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨 酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而 被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性 质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二 氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
第三节 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型 载体分子量大。
第四节 核酸杂交检测法
一、原理： 1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素
32P 或 125I 。
（2）非放射性标记
荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体）， 再用探针杂交。
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样品。
主要检测插入片断 是否被转录。
从宿主细胞中提取 RNA，再用探针杂 交。
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且 表达出相应的蛋白质的外源基因。
物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定 有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子 的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察
2. ELISA检测的一般步骤
（1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，吸附后就被固定在孔底。
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B