关于生物技术综合实验报告

关于生物技术综合实验报告

生物技术综合实验

甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达

学生：学号：

同实验者：

谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 爱惜细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 能够调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫进程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆进程紧密相关。

实验一甘薯叶片RNA提取

一、实验目的

1. 了解真核生物RNA提取的原理；

2. 把握Trizol提取的方式和步骤。

二、实验原理

Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解进程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成份的同时维持RNA的完整性。TRIzol 的要紧成份是苯酚。苯酚的要紧作用是裂解细胞，使细胞中

的蛋白，核酸物质解聚取得释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。%的8－羟基喹啉能够抑制RNase，与氯仿联合利用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，致使细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的要紧作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方式取得的总RNA中蛋白质和DNA污染很少。

三、实验材料

1. 材料

甘薯叶片，品种为徐薯18

2. 试剂

①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处置留宿后高压灭菌；

②Trizol试剂；

③氯仿；

④异丙醇、75％乙醇；

⑤TBE缓冲液；

⑥上样缓冲液

3. 仪器

高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和EP 管架

四、实验方式

1. 将叶片掏出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充割裂解；

2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿，用手猛烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相；

3. 4℃12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰凉的异丙醇，室温放置15 min；

4. 4℃12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底；

5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；4℃8,000 rpm离心2 min，弃上清；

6. 室温放置10 min晾干沉淀；

7. 沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保留；

8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。

五、实验结果

1. RNA提取结果

依照Trizol 试剂盒方式，提出的RNA较少，此部份未以图或数据显示。

2. RNA后电泳结果

如图1. 其中9a为本组实验结果。由图可知RNA条带超级模糊，拖尾现象严峻，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔周围的红色部份为杂质，在提取进程中并未专门好除去。

图1. RNA提取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker，9a泳道为本小组RNA样品。与标准对照可见条带模糊，拖尾现象严峻。

六、分析与讨论

1. RNA的提取

产量并非多，可能是因裂解样品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在实验进程中，由于对操作时刻的把握不熟练、操作技术不完善，留上清与弃上清时令RNA损失了部份，使最终RNA产量不睬想。

2. RNA电泳结果

有EB存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应看得很清楚，另显现条由tRNA，rRNA和5S rRNA 组成的较模糊、迁移较快的带。若是

RNA没有降解，那么28S rRNA的亮度应为18S rRNA 的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。由图1. 9a可知，RNA拖尾现象严峻，说明RNA已大部份被降解；另外点样孔周围显现红色部份杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，一样阻碍RNA电泳结果。

在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源

RNAase进入样品，致使其降解严峻。另外，提掏出RNA 后本小组未当即将样品放入-70℃保留，也为致使结果不睬想的重要缘故之一。在最初用氯仿萃取分层的进程中，由于水相吸取过量，搀杂入部份蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA条带拖尾严峻可能还受该蛋白质阻碍。

七、总结：

本次实验RNA提取超级失败，从跑胶结果可见其降解严峻。尽管大实验无法幸免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会阻碍实验结果，但从图

1. 2a，3a，2b等条带较为清楚的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量和试剂对结果干扰不大。那么本小组成员在提取进程中的操作必然显现了专门大失误。第一口罩、手套应该严格按规定佩带，提取进程对移液枪等仪器利用需谨慎认真，尽可能幸免混入杂质。第二为排除部份杂质阻碍可对RNA样品用紫外线分光光度计测定吸光值查验，将有助于结

果分析。最后，细节决定成败，咱们应汲取教训幸免接下来的实验显现类似问题。

实验二第1链cDNA的合成和模板的验证

一、实验目的

1. 把握第1链cDNA的合成方式和步骤

二、实验原理

真核生物基因多为断裂基因，编码区不持续，需经转录后加工才能成为成熟mRNA。以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，进而取得有持续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。

真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：Oligo dT。莫洛尼

氏鼠白血病毒逆转录酶以单链RNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链。

mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA 的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的经常使用方式。

三、实验材料

1. 材料

徐薯18叶片RNA样品

2. 试剂