蛋白酶液化淀粉酶活力的测定

（二）酶活力的测定意义
酶不易制成纯品，会含很多杂质，真正的含酶量并不多。 所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。 定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引 起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。 则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘-碘化钾与反应 液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物 有淀粉酶的活力。 酶活力的测定：实际上是酶的定量测定，酶制剂因含杂 质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。
（六）抑制剂对酶作用的影响
——使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学 性质改变而降低酶活力甚至使酶丧失活性的物质， 称为抑制剂（ inhibitor, I）。 由抑制剂所引起的酶活力降低或丧失称为抑 制作用（inhibition）。 凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用 称为失活作用（inactivation）。
（2）偶联的连续法
是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或 间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必 须在酶反应相同条件（pH、温度等）下进行，且加入的指示 酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。 如醛缩酶(Aldolase)催化1，6—二磷酸果糖生成3-P—甘油 醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出.用磷酸 丙糖异构酶(Triose Phosphate lsomerase))来作偶联酶 (Coupling Enzyme)， 甘油—1—P—脱氢酶(Glycerol-1Phosphate Dehydrogenase)来作指示酶依据NNADH变成NAD+ 的光谱变化来算出醛缩酶活性。 如下图：
在测定酶活力时，对反应温度、pH值、底物
浓度、作用时间都有统一规定，以便同类产品互相比 较。 酶单位并不直接反映出酶的绝对数量，它只不过 是一种相对比较的依据。
在评价纯化酶的操作方法是优劣时，要同时考虑两个概念： 纯化倍数与回收率 纯化倍数=某纯化操作后的比活力/第一步操作后的比活力 回收率=某纯化操作后的总活力/第一步操作后的总活力
醛缩酶以l—P—甘油脱氢酶 为指示酶的偶联测定酶活性法
3、酶活力测定中应注意的几个问题 酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进 行的，但酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物 以外，还有酶这样一个决定性因素。因此，酶活性测定除 了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的— 些特点。
（四）酶的活力单位
①国际单位IU：1961年，在最适条件下每分钟转化 1μmol底物所需要的酶量为一个酶活力单位。
即1IU= 1μmol/min ②国际单位Kat：1972年，指在最适条件下1秒钟内 转化1mol底物所需的酶量。 即 1 Kat=1mol/s
Kat和IU的换算关系：1 Kat=6×107 IU， 1 IU =16.67n Kat
（六）酶活力测定的基本原理 一般对酶的测定不是直接测定其酶蛋白浓度,
而是测定其催化化学反应的能力。这是基于
①在最优化条件下(最适温度、最适pH、最适缓冲液等)， ②当底物足够（过量， [S]>>[E] ） ，
③在酶促反应的初始阶段， 酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比 （即V=K［E］）。故酶活力测定的是化学反应速度， 一定条件下可代表酶活性分子浓度。
（三）酶活力的概念：
指酶催化特定化学反应的能力。其大小通常用在一定 条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示。一定量的 酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。 速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，测初速度，多用后者。因
为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物
从无到有，易测定。 酶活力又称酶活性。
（3）放射性化学法
是由具有放射性的产物上测出全放射量， 再算出产物量，从而计算出酶的活性. 优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定， 也可用于体内酶活性测定，特别适用于低浓度的 酶和底物的测定。 缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应 过程无法连续跟踪，并且同位素对人体有损伤作 用。此外，辐射淬灭会引起测定误差，如3H发 射的射线很弱，甚至会被纸吸收。
第八节 蛋白酶活力的测定
一、蛋白酶酶活概述 二、影响酶促反应速度的因素—酶促反应动力学 三、蛋白酶活力的测定
第八节 蛋白酶活力的测定
一、蛋白酶酶活概述 （一）酶
1、酶的定义 酶是由生物活细胞产生的有催化功能的蛋白质， 只要不处于变性状态，无论在细胞内或细胞外都可 发挥催化化学反应的作用。 酶及辅酶 有些酶是简单蛋白质，有些酶是结合蛋白质， 一般把结合蛋白质的蛋白部分称为酶蛋白，非蛋白 质部分称为辅酶。
③习惯单位: 在实际使用中,不同酶有各自的规定,如: 糖化酶活力单位:在规定条件下,每小时转化 可溶性淀粉产生1mg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶 量为1个酶单位。 蛋白酶活力单位：规定条件下，每分钟分解 底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。
（五）酶的比活力
比活力（比活性）是指每单位质量样品中 （酶蛋白）的酶活力单位数，即每 mg 蛋白质中 所含的 U 数或每 kg 蛋白质中含的 kat 数； 有时用单位体积中的酶活力单位表示比活 力。 酶的比活力即表示酶的含量（纯度），是 表示酶制剂纯度的一个指标。 如在酶的提纯过程中，随着酶逐步被纯化， 其比活力也在逐步增加。
——凡能提高酶活力的物质都称之为该酶的激 活剂。如Cl 是唾液淀粉酶的激活剂。
大多为金属离子:如K+, Na+, Ca2+, Mg2+, 2+, Fe2+ 等 Zn 无机离子 激 活 剂 少数为阴离子:如Cl-,Br-,I-,CN-,PO43- 等 小分子有机物：如Vc, Cys, GSH, 胆汁酸盐等 生物大分子：如蛋白激酶，激活酶原的蛋白酶等
3. pH影响底物有关基团的解离。
（四）温度对酶作用的影响
两种不同影响：
1. 温度升高，反 应速度加快； 2. 温度升高，热 变性速度加快。
v
最适温度
T
酶的最适温度: 在一定条件下，酶表现最 大活力时的温度。
酶的最适温度不是一个固定的常数，其数 值受底物种类、作用时间等因素影响而改变。
（五）激活剂对酶作用的影响
初速度的确定是在底物浓度([S])足够的条件下，通过[E] 的变化来确定 如下图.由图可见，当分别采用不同的酶浓度时， 测得反应量对时间的变化。
求得几个适当时间的反应速度(反应量／反应时间)。再用 反应速度对酶量作图 。由图可见．其中，5min时测得的数据 可用于求出初速度，若以10min以上数据时，测得的酶活性偏 低。
总活力＝单位体积的酶活力(U/ml)×分离溶液总体积(ml)
（七）酶活力的测定方法（动力学法）
酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑 制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测 定可用终止反应法或连续反应法（动力学法）。 1 终止反应法(Stopped Method) 终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应 物或产物，予以分离，再确定反府物的消耗量，或产物的形 成量，算出酶活性。产物的测定方法可用酶法、化学法或放 射化学法。 使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也 可用SDS）使酶失活或加热使酶变性等。
偶联法中偶联酶对反应速度的影响
再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）： 葡萄糖＋ATP→葡萄糖-6-P 其偶联-指示剂 为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 葡萄糖-6-P+NADP+ →6-P-葡萄糖酸+NADPH+H+ 这时即可测定340nm处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄 糖激酶）的活性. 酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。 （2）化学法 化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理 方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度 法等方法测出酶活性.
一些酶的最适 pH 值
酶 胃蛋白酶 过氧化氢酶 最适 pH 1.8 7.6
胰wenku.baidu.com白酶
延胡索酸酶
7.7
7.8
核糖核酸酶
精氨酸酶
7.8
9.8
酶的最适pH只在 一定条件下才有 意义－－ 酶的最适pH 不是固定的常数, 其数值受酶的纯 度、底物种类和 浓度、缓冲液种 类和浓度等影响
pH影响酶活力的原因：
1. 环境过酸、过碱可使酶的空间结构破坏， 引起酶构象的改变，酶变性失活； 2. pH改变能影响酶分子活性部位上有关基团 的解离，从而影响与底物的结合或催化；
化学分析法的优点是:不需要特殊仪器,一般有恒温水浴、 滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于 绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体 的测定方法，应用范围较广。
缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得， 取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反 应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不 容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。 目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、 停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排 成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在 对化学分析法必须作出新的评价。
v Vm 0.3
[S]与v关系： 当[S]很低时，[S]与v成比例-- 一级反应 当[S]较高时，[S]与v不成比例-混合级反应 当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应
0.2 Vm 2 0.1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
[S]
（三）pH对酶作用的影响
1. pH稳定性 在一定的pH范围 内酶是稳定的。 2. 最适pH －－酶表现最大活力的pH值。
（1）酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光 光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如 葡萄糖氧化酶催化的下列反应： 葡萄糖+O2→葡萄糖内脂+H2O2 欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧 化物酶和木酚，使发生下列反应:
由于4—甲氧联酚在435nm波长处有光吸收峰，因此、只 要测定A435，就可知4—甲氧联酚的量，可得H202的量，从而 可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶)必须过 量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在5 倍以上。
2 连续反应法(Continuous Method) 连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸 收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测 反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便， 一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能 用该法测定。 （1）一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、 旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光 度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪 的普遍使用使该法更容易被人们所接受。 下表即是几种连续法的例子：
二、影响酶促反应速度的因素－－酶促反应动力学
酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其 影响因素的科学。
1.酶浓度[E] 2.底物浓度[S] 3.反应温度 4.pH值 5.激活剂 6.抑制剂
（一）酶浓度对酶作用的影响
在有足够底物和其他条件不变、无任何 不利因素的情况下：
v
o
v = k [E]
[E]
（二）底物浓度对酶作用的影响
首先测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度 才与底物浓度成正比。初速度的确定一般指：底物消耗 量在5％以内，或产物形成量占总产物量的15％以下时的 速度。 其次，底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度 (即过饱和)，否则，底物浓度本身是—个限制因子，此时 的反应速度是两个因素的复变函数。 第三，反应必须在酶的最适条件(如最适温度、PH 和离子强度等)下进行。此外，测定酶活性所用试剂中不 应含有酶的激活剂、抑制剂； 同时底物本身不要有裂解。用反应速度(v)对酶浓 度( E)作图，应得一条通过原点的直线，即v为（E）的线 性函数。
（七）酶活力的测定方法（使用仪器分类） 1、分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。
2、测压法：产物中有气体，测气压增加量。
3、滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。 4、荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法。 5、旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。 除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。