RP-HPLC-MS方法分析几种蛋白的胰蛋白酶酶解多肽产物的-赛默飞

RP-HPLC-MS方法分析几种蛋白的胰蛋白酶酶解多肽产物的条件优化

引言

在生物体内，蛋白的翻译后修饰过程是蛋白发挥各种不同生化功能的基础，这些翻译后修饰包括糖基化、氧化、甲基化和磷酸化等。作为生物药物的蛋白在生产、运输、保存过程中会产生变体，从而影响到药物的活性和稳定性。因此蛋白的肽谱经常被用来研究蛋白的翻译后修饰过程以及蛋白变体的存在。同时也用于生物制药行业蛋白产品初级结构的确认 [1-3] ，从而更好地控制生化药品的质量和确保病人的用药安全。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物-多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

仪器配置

Thermo Ultimate 3000系统：泵：DGP-3600RS；自动进样器：WPS-3000TRS；柱温箱：TCC-3000RS；检测器：DAD-3000RS 质谱：TSQ Vantage

色谱软件：Chromeleon 6.8

测试条件

与紫外检测器兼容的液相色谱条件

色谱柱： 1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691, S/N001119)；

2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；

3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/

N1008512×7, LOT10603)；

流动相： 95%超纯水+5%乙腈+0.1%TFA：5%超纯水

+95%乙腈+0.08%TFA, 梯度洗脱：

Time/min A/%B/%

0982

404060

40.12080

452080

45.1982

60982

流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)

分析时间：60 min

检测器波长：214 nm

进样量：20 µL

柱温：35 ℃

与质谱兼容的液相色谱条件

色谱柱：1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/

N063691,S/N001119)；

2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；

3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/

N1008512×7, LOT10603)；

流动相：A：2%乙腈, B：98%乙腈, C：10 mmol/L 醋酸铵，用乙酸调节pH=3.75, D：10mmol/L 醋酸铵，

用氨水调节pH=9.79,梯度洗脱：

Time/min A/%B/%C/D% -5.078220

0.078220

60305020

60.108020

6508020

65.178220

7578220

张婷婷金燕

赛默飞世尔科技（中国）有限公司

2

流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min

质谱条件：离子化方式： ESI, Positive Voltage: 3000 V; Capillary Temperature: 350.0 ℃ Vaporizer Temperature: 400.0 ℃

Sheath Gas Pressure: 40.0 arb, Ion Sweep Gas

Pressure: 0 arb Auxiliary Gas Pressure: 12.0 arb; Scan Range ：150- 1500 m/z 质谱扫描参数：Scan time 0.286 s 分辨率：Q1Peak Width 0.7 FWHM.进样量：20 µL 柱温：35 ℃样品前处理准备牛血清白蛋白(BSA)、马肌红蛋白、细胞色素C 以及胰蛋白酶(Trypsin)四种蛋白标准品。胰蛋白酶酶解过程：

1、称量5 mg 蛋白到离心管中，加入1 ml 的6 mol/L 的盐酸胍溶液(盐酸胍固体溶解于100mmol/L 的NH 4HCO3，

pH=8.0)，溶解混匀；2、加入20 µl 的0.5 mol/L 的二硫苏糖醇(DTT)到离心管中，混匀。在56 ℃保温60 min ；3、冷却到室温；4、加入40 µl 的0.5 mol/L 的碘乙酰胺到混合溶液中，混匀。避光在室温下放置30 min ；5、加入80 µl 的0.5 mol/L 的DTT 到混合溶液中，混匀。室温放置30 min ；6、透析(3.5KD 分子量)烷基化的蛋白样品，在2L 的50 mmol/L 的甲酸铵溶液中室温透析24小时，其中更换一次透析溶液；

7、将2 mg 的胰蛋白酶溶解于200 µl 的碳酸氢铵溶液(0.1 mol/L)中。取20 µl 的胰蛋白酶溶液(1 µg/µl)到蛋白混合液中。

混匀，37 ℃酶解20小时；在沸水中加热15 min 终止酶解反应；8、酶解液用0.22 µm 有机滤膜过滤

，直接上机分析。结果和讨论

前处理过程的考察1、胰蛋白酶酶解原理利用蛋白水解酶可将蛋白质水解，产生小肽和多肽片断(一般将10个氨基酸以下的称为寡肽或者小肽，10个氨基酸

以上的称为多肽)。胰蛋白酶为蛋白酶的一种，是肽链内切酶，选择地水解蛋白质中所有的由赖氨酸(Lys)或(精氨酸) Arg 的羧基所构成的肽键。酶水解的优点是专一性强，利用不同的水解酶可有专一的切点，在蛋白质的一级结构的测定上非常有用。2、胰蛋白酶酶解过程考察

按照样品前处理方法的胰蛋白酶酶解过程

，分别对三种蛋白(细胞色素C 、牛血清白蛋白和马肌红蛋白)进行酶解，处理后样品在反相色谱条件下进行分析。如图1所示为马肌红蛋白酶解液的液相色谱图，图2为其中几个色谱峰的MS 定性图谱，表1将部分马肌红质谱数据与文献中的质谱数据进行比较，能够确认马肌红蛋白酶解的几个特征肽

谱，表明胰蛋白酶酶解和分离的结果与文献

[4]一致，满足分析要求。 1、称量5 mg 蛋白到离心管中，加入1 ml 的6 mol/L 的盐酸胍溶液（盐酸胍固体溶解于100mmol/L 的NH4HCO3，pH=8.0），溶解混匀；

2、加入20 μl 的0.5 mol/L 的二硫苏糖醇（DTT ）到离心管中，混匀。在56 ℃保温60 min ；

3、冷却到室温；

4、加入40 μl 的0.5 mol/L 的碘乙酰胺到混合溶液中，混匀。避光在室温下放置30 min ；

5、加入80μl 的0.5 mol/L 的DTT 到混合溶液中，混匀。室温放置30 min ；

6、透析（3.5KD 分子量）烷基化的蛋白样品，在2L 的50 mmol/L 的甲酸铵溶液中室温透析24小时，其中更换一次透析溶液；

7、将2 mg 的胰蛋白酶溶解于200 ul 的碳酸氢铵溶液（0.1 mol/L ）中。取20 μl 的胰蛋白酶溶液（1 μg/μl ）到蛋白混合液中。混匀，37 ℃酶解20小时；在沸水中加热15 min 终止酶解反应；

8、酶解液用0.22 μm 有机滤膜过滤，直接上机分析。

结果和讨论

前处理过程的考察1胰蛋白酶酶解原理 利用蛋白水解酶可将蛋白质水解，产生小肽和多肽片断（一般将10个氨基酸以下的称为寡肽或者小肽，10个氨基酸以上的称为多肽）。胰蛋白酶为蛋白酶的一种，是肽链内切酶，选择地水解蛋白质中所有的由赖氨酸（Lys ）或（精氨酸）Arg 的羧基所构成的肽键。酶水解的优点是专一性强，利用不同的水解酶可有专一的切点，在蛋白质的一级结构的测定上非常有用。 2 胰蛋白酶酶解过程考察 按照样品前处理方法的胰蛋白酶酶解过程，分别对三种蛋白（细胞色素C 、牛血清白蛋白和马肌红蛋白）进行酶解，处理后样品在反相色谱条件下进行分析。如图1所示为马肌红蛋白酶解液的液相色谱图，图2为其中几个色谱峰的MS 定性图谱，表1将部分马肌红质谱数据与文献中的质谱数据进行比较，能够确认马肌红蛋白酶解的几个特征肽谱，表明胰蛋白酶酶解和分离的结果与文献[4]一致，满足分析要求。

RT:0.00 - 85.00

图 1. 马肌红蛋白酶解液液相色谱图