拟南芥

用农杆菌介导法将拟南芥miR395d基因转入油菜中的

方法研究

目的基因的来源

目前由于油菜的核酸序列库相对较小,通过生物信息学分析尚未在油菜中找到miR395前体序列,而油菜与拟南芥同属于十字花科,亲缘关系比较近,且miR395在各物种间序列保守,因此为了进一步研究miR 395对油菜中sulfate trans porter 2; 1和ATP硫酸化酶的作用机制, 提高油菜在缺硫等逆境中的适应性,本研究采用PCR方法从拟南芥中克隆到了miR395d前体基因。

目的基因的研究近况

MicroRNAs(miRNAs)是一类内生、非编码蛋白长度约为21～24个核苷酸的单链小分子RNA在生物体内起着基因转录后的调控作用作为重要的调节分子,miRNA参与生命过程中一系列的重要进程, 包括生长发育、信号转导、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发生等也有一些研究报道指出,miRNA在调节植物对环境胁迫如干旱、盐害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用。

目的基因作用机理

目前在拟南芥中已有研究证实,miR39与硫同化途径中的第1个关键酶ATP硫酸化酶mRNA (APS1、APS3、APS4)存在互补序列。经初步Northern杂交分析显, 缺硫植株中的miR395被诱导表达, 而APS的积累量明显减少, 表明拟南芥miR395在缺硫条件下参与对其

靶基因APS1的负调控。此外, 5′RACE结果显示, 编码拟南芥的一个低亲和硫转运体sulfate trans porter 2; 1 ( AST68)的mRNA 也是miR39的一个靶基因, 说明miR395在植物硫同化和转运途径中可能起到了非常重要的调节作用。

实验意义

油菜作为一种重要的油料和经济作物, 在硫的吸收、转运及代谢中同样需要硫转运体和ATP 硫酸化酶的协助为研究miR395对油菜中sulfate trans porter 2;1和ATP硫酸化酶的作用机制, 提高油菜在缺硫等逆境中的适应性, 采用PCR方法从拟南芥中克隆到了miR395d前体基因, 并构建过表达载体, 通过采用根癌农杆菌介导法将miR395d前体基因导入甘蓝型油菜特选号中, 目前已获得了转基因植株。

材料与方法

1. 1材料

1. 1. 1 植物材料供试材料为拟南芥哥伦比亚生态型, 甘蓝型油菜品种特选4号。

1. 1. 2质粒及菌株大肠杆菌菌种DH5α, 农杆菌菌种EHA105, 表达载体质粒pCAMBIA1304。

1. 2方法

1. 2. 1拟南芥DN的提取用CTAB法从幼嫩的拟南芥叶片中提取DNA。

1. 2. 2拟南芥miR395d前体基因的克隆参照拟南芥miR395d前体基因序列设计引物, 为了便于miR395d过表达载体的构建, 在上游

引物的5′端加入BglⅡ酶切位点,下游引物5′端加入SpeⅠ酶切位点,以拟南芥DNA为模板, PCR扩增466 bp左右的miR395d前体基因。引物序列如下:上游引物S1:5′-AGATCTATGTCACCCATCCTATCTT CCTCA-3;

下游引物S2:5-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA-ACCTGTA-3′。PCR反应体系:10×缓冲液(含Mg2+ )5μL,10 mmol·L-1dNTP2μL , 10μmol·L-1引物各2μL,cDNA第1链模板2μL,Taq酶(5U·μL-1)1μL, ddH2O38 μL。扩增条件如下:94℃4min ;94℃30s , 58℃30 s , 72℃30 s , 30个循环;72℃7 m i n 。

1. 2. 3PCR产物的回收与测序PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后与克隆载体pMD19 T Vector连接,转化DH5α感受态细胞,在含有Isopropyl-β- D - thiogalactoside(IPTG)、X-gal和Amp的LB 平板上挑选单克隆, 单克隆经鉴定后测序。

1. 2. 4拟南芥miR395d前体基因过表达载体构建用限制性内切酶Bgl Ⅱ和SpeⅠ对pCAMBIA1304和pre-miR395d分别进行双酶切, 酶切产物进行凝胶电泳后回收, 将回收产物用T4DNA连接酶连接, 16℃过夜,得到过表达载体,命名为pCAMBIA1304- miR395d ,对重组子进行PCR和序列测定。

1. 2. 5根癌农杆菌介导法转化油菜无菌苗培养:选取籽粒饱满的油菜种子用70%乙醇表面消毒30 s ,再用1g·L-1HgCl2消毒5min, 无菌水冲洗5次, 接种于种子萌发培养基( M S )上, 置25℃光照培养箱中, 每天光照12h 。预培养: 待无菌苗长至第7天, 分别切取子叶和下

胚轴为转化的外植体, 置于预培养基：(MS+2 mg·L-16BA+ 0. 1mg·L- 12, 4D , pH6. 2)中, 黑暗预培养3d。农杆菌对外植体的侵染与共培养:将含pre-miR395d过表达载体的农杆菌接种于LB+20 mg·L-1Rif + 50 mg·L-1Kan液体培养基中( 5mL ),28℃振荡培养过夜, 再转入40mL新鲜的上述液体培养基中振荡培养3～5h ,当菌液处于对数生长期( D600为0.3～0.4)时, 6000r·min-1 离心5min ,弃上清液,加入5倍体积的MS液体培养基悬浮菌液备用。将预培养3d的外植体浸入侵染液中,子叶浸泡5min,下胚轴浸泡30s , 用滤纸吸去多余液体, 紧密排列在MS固体培养基中,暗培养2d。脱菌培养和筛选培养:将共培养2d的子叶和下胚轴移至脱菌培养基(MS+2mg·L-16 BA+0. 1mg·L-1-1AgNO3+50mg·L-1Timentin ,pH6.2)中, 6d后转入筛选培培养基(MS+2mL-16BA+0.1mg·L-1NAA+6mg·L-1AgNO3+

50mg·L-1Timentin+20mg·L-1Hygromycin(潮霉素) , pH6.2)中, 15d 更换1次培养基。将分化约1～2c的绿芽切下转入壮苗培养基(MS+2mg·L-16 B A+ 0. 1 m g·L-1NAA+6mg·L-1AgNO3 +50 mg·L-1Timentin, pH6.2)中。待分化芽苗长至3～5cm时转入生根培养基(1/2MS)中。

1. 2. 6转基因油菜PCR检测CTAB法提取油菜总DNA,并用35S启动子序列设计上游引物S3:5-TGTGATGGTCCGATTGAG-3′,与miR395d下游引物S2进行PCR , 扩增片段长度为850bp左右, PCR 阳性对照模板为质粒pCAMBIA 1304-miR395d ;阴性对照为未经转化