干扰素的工艺制备流程讲解
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直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金 淋巴瘤。
免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症 rhuIFNβ
2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺
干扰素生产工艺路线
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类
◆ I 型干扰素：IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω
来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
◆ II 型干扰素：干扰素γ（IFN)
来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）
2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。
Байду номын сангаас
不同来源的干 扰素
1.2 重组干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。
疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白
洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）
等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电 导值40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜
超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。
透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku 超滤膜，0.005 M缓冲液。
基因工程菌的制备
目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→ → 受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
→ 导入大肠杆菌 受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与扩增
1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
（4）无菌试验
同半成品。
（5）热原质试验
同半成品检定。
（6）干扰素效价测定
同半成品检定，效价不应低于标示量。
（7）安全试验
取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射
量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚
鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。
四、受体菌的筛选
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体 重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆 载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况
五、分析保存
对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。
干扰素的发酵工艺过程
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备
成品检定
4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机， 16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、 菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。 菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个 月，检查一次活性。
3. 干扰素的分离纯化工艺过程
3.1、干扰素分离工艺过程 3.2、干扰素的纯化工艺过程
取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人
每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存
活，说明成品合格。
4 国内基因工程药物产业发展状况
我国的生物技术药物却一直苦于缺乏 自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿 制药，创新药物的开发一直未能打开局面。
一种新药从研发到投放市场，投入大 约为30亿~60亿美元。
EcoR I
BamH I
EcoR I
BamH I
2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选
三、重组体引入宿主细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku 超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。
检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。
(2) 沉淀与疏水层析
等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白， 离心收集上清液。
发酵培养 半成品检定
成品包装
粗提 分装
1．菌种培养
取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种
子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，
pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定
和发酵液杂菌检查。
2．种子罐培养
将已活化的菌种接入装有30L培养基的
种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通
区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。
（5）相对分子量测定
还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相
对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对
分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比
较，误差不得高于10%。
（6）残余外源性DNA含量测定
用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外
基因工程药物 --干扰素的制备
1 什么是干扰素
概念(interferon,IFN)：机体 免疫细胞产生的一类细胞因 子，是机体受到病毒感染时， 免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、 功能接近的生物调节蛋白。
根据分子结构和抗原性的差 异分为α、β、γ、ω等4个类 型。
1.1天然干扰素的分类
电泳切取目的基因片段 3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA 4. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干
扰素基因的PCR产物 5.人工加尾形成“粘性末端”
二、构建重组质粒
1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因
的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接
加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行 沉淀。
(3)离心
连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
源性DNA应低于100pg。
（7）残余血清IgG含量测定
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
（8）残余抗生素活性测定
半成品中不应有抗生素活性存在。
（9）紫外光谱扫描
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。
（10）肽图测定
用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批
与批之间应一致。
（11）等电点测定 等电聚焦电泳。
（12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质 试验。
成品检定
（1）物理性状
冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得
含有肉眼可见不溶物。
（2）鉴别试验
应用ELISA或中和试验检定。
（3）水分测定
用卡氏法，应低于3%。
(3)无菌过滤分装
0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液 分装 －20℃以下的冰箱中保存。
(4)检测项目
干扰素鉴别试验 干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素
半成品检定
（4）初级分离
盐析: 硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
3. 2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析
阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装
(1) 溶解粗干扰素
存在的问题：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞 争， 严重影响产业的健康发展。
（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。 （3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。 （4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮 乏。
气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入
发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线
检查，控制杂菌
3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接 种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃， pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至 15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
（1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测
系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。
（2）蛋白质含量测定
福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋
白为标准。
（3）比活性
效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。
（4）纯度
电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一
3.1 干扰素分离工艺过程
菌体裂解 预处理 初级分离
(1)菌体裂解
裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
(2)预处理-沉淀
免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症 rhuIFNβ
2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺
干扰素生产工艺路线
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类
◆ I 型干扰素：IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω
来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。
◆ II 型干扰素：干扰素γ（IFN)
来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）
2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。
Байду номын сангаас
不同来源的干 扰素
1.2 重组干扰素的临床应用
广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。
疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白
洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）
等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电 导值40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜
超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。
透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku 超滤膜，0.005 M缓冲液。
基因工程菌的制备
目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→ → 受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
→ 导入大肠杆菌 受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与扩增
1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
（4）无菌试验
同半成品。
（5）热原质试验
同半成品检定。
（6）干扰素效价测定
同半成品检定，效价不应低于标示量。
（7）安全试验
取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射
量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚
鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。
四、受体菌的筛选
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体 重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆 载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况
五、分析保存
对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。
干扰素的发酵工艺过程
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备
成品检定
4. 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机， 16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、 菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。 菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个 月，检查一次活性。
3. 干扰素的分离纯化工艺过程
3.1、干扰素分离工艺过程 3.2、干扰素的纯化工艺过程
取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人
每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存
活，说明成品合格。
4 国内基因工程药物产业发展状况
我国的生物技术药物却一直苦于缺乏 自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿 制药，创新药物的开发一直未能打开局面。
一种新药从研发到投放市场，投入大 约为30亿~60亿美元。
EcoR I
BamH I
EcoR I
BamH I
2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选
三、重组体引入宿主细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku 超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。
检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。
(2) 沉淀与疏水层析
等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白， 离心收集上清液。
发酵培养 半成品检定
成品包装
粗提 分装
1．菌种培养
取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种
子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，
pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定
和发酵液杂菌检查。
2．种子罐培养
将已活化的菌种接入装有30L培养基的
种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通
区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。
（5）相对分子量测定
还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相
对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对
分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比
较，误差不得高于10%。
（6）残余外源性DNA含量测定
用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外
基因工程药物 --干扰素的制备
1 什么是干扰素
概念(interferon,IFN)：机体 免疫细胞产生的一类细胞因 子，是机体受到病毒感染时， 免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、 功能接近的生物调节蛋白。
根据分子结构和抗原性的差 异分为α、β、γ、ω等4个类 型。
1.1天然干扰素的分类
电泳切取目的基因片段 3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA 4. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干
扰素基因的PCR产物 5.人工加尾形成“粘性末端”
二、构建重组质粒
1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因
的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接
加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行 沉淀。
(3)离心
连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
源性DNA应低于100pg。
（7）残余血清IgG含量测定
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
（8）残余抗生素活性测定
半成品中不应有抗生素活性存在。
（9）紫外光谱扫描
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。
（10）肽图测定
用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批
与批之间应一致。
（11）等电点测定 等电聚焦电泳。
（12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质 试验。
成品检定
（1）物理性状
冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得
含有肉眼可见不溶物。
（2）鉴别试验
应用ELISA或中和试验检定。
（3）水分测定
用卡氏法，应低于3%。
(3)无菌过滤分装
0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液 分装 －20℃以下的冰箱中保存。
(4)检测项目
干扰素鉴别试验 干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素
半成品检定
（4）初级分离
盐析: 硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
3. 2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析
阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装
(1) 溶解粗干扰素
存在的问题：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞 争， 严重影响产业的健康发展。
（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。 （3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。 （4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮 乏。
气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入
发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线
检查，控制杂菌
3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接 种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃， pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至 15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
（1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测
系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。
（2）蛋白质含量测定
福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋
白为标准。
（3）比活性
效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。
（4）纯度
电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一
3.1 干扰素分离工艺过程
菌体裂解 预处理 初级分离
(1)菌体裂解
裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
(2)预处理-沉淀