抗体的制备及应用.

3、离子交换法

•
原理
利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合 力的差异进行物质分离. DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基) 将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷. 采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子 (Cl-)置换被分离的组分.
2 2 1 3 1
2
3 2
1
3
2
3
1
1
2 3
2 1
购买抗体时要注意厂商的标注
适合于做什么实验,使用浓度多少
• • • • • •
WB（Western blotting ，免疫印迹) IH (Immunohistochemistry, 免疫组织化学) IC (Immunocytochemistry, 免疫细胞化学) IEM (Immune lectron microscopy,免疫电镜) FCM (Flow Cytometry,流式细胞仪) ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶联免疫吸附实验,酶联免疫分析)
但能在体外长期生存）
阳性杂交瘤细胞 (hybridoma)
1 2 1 2
2 2 2
（既能分泌特异性抗体， 又能够在体外长期生存）
克隆化培养
（产生单克隆的阳性杂交瘤细胞）
生产单克隆抗体
2、多抗的制备
常用的免疫动物
免疫的基本步骤
如何免疫兔子
1）常用的免疫动物
•
•
•
兔子（rabbit）：最常用于自制抗体， 抗体量较多。（新西兰,大耳白） 小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但 抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠） 大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过 程要麻醉动物。（Wistar大鼠）
•
•
•
羊（sheep、goat）：常用于较大批量地 生产抗体（商品）。 马（horse）：常用于大批量生产治疗用 抗体（商品）。 豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。
2）免疫的基本步骤
•
•
基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全 佐剂（Complate Freund’ adjuvand , 含矿物油,卡介苗等). 加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次， 间隔2-4周，用佛式不完全佐剂 (Incomplate Freund’ adjuvand , 不含卡介苗).
2、多克隆抗体的特点
多抗是单抗的混合物，因此多抗的性 质是一个群体综合的性质。 特异性一般比单抗差 因为由不同性质的抗体组成，只要其 中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉 反应，所以多抗更容易有交叉反应。
比单抗更容易捕捉抗原。 因为含有抗不同表位的抗体，多种抗 体都可与抗原结合。 抗体的纯化、标记比单抗难 因为含有各种不同类型、亚类的抗体， 提纯、标记的方法有所差别。同时,血 清中含有的杂蛋白比较多.
单抗与多抗的区别
抗体组成 抗体性质 纯化标记 种属来源 制备周期 制备技术 经费
单抗 单一 个体的属性 容易，效果好 绝大多数是小鼠 长 (最短4个月） 复杂 多
多抗 复杂 群体综合的性质 难度高一些 兔子、羊、豚鼠等 短（2个月） 简单 少
什么情况需要制备单抗
目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂

主要步骤：
• • • • • 调节样品的pH值,加入正辛酸(25ul/ml),搅拌30分；。 室温高速离心(10000g，30分钟),收集上清液； 再加入硫酸铵（40%饱和度）； 4℃高速离心(10000g，15分钟) ,弃上清； 溶解沉淀，透析，测定浓度。
特点
• • •
•
成本较低，步骤较复杂。 抗体回收率很低。 抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种 标记。 需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。

二、抗体的制备
1、单克隆抗体的制备

无法采用生物化学的方法从多抗中分离 必须采用细胞杂交的方法来制备 能否筛选到理想的单克隆抗体有技术问 题也有机遇问题
制备单克隆抗体的基本原理：
致敏的B淋巴细胞 （能够分泌特异性的抗体 ，
不能在体外长期生存 ）
骨髓瘤细胞 （myeloma） （不能分泌特异性的抗体，

三、抗体的纯化
盐析法（硫酸铵沉淀) 辛酸-硫酸铵沉淀法 离子交换法 亲和层析法 凝胶过滤法
1、盐析法（硫酸铵沉淀)
原理 • 在高浓度中性盐存在下,蛋白质在水中
的溶解度降低而产生沉淀 • 硫酸铵是最常用的中性盐 • 不同蛋白质的盐析常数不同 • 硫酸铵的加入量通常以饱和度表示 (100%饱和度:767g/L)
•
•
使用前
样品结合(Binding)
洗脱(Elution)

• •
主要步骤
将Protein A与活化的柱子相结合(买商品柱)； 将腹水或血清处理后过柱； 用结合缓冲液洗柱子，直到A280值为零； 用甘氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液； 测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品； 汇集样品，浓缩，测定浓度。
• • • •
成本低，步骤简单。 抗体的回收率比较高。 抗体纯度比较低，电泳后可见到明显 的杂带,不适合于做各种标记。 需要高速离心机。
2、正辛酸-硫酸铵沉淀法
原理 两步沉淀： • 先加正辛酸去杂蛋白. 正辛酸是一种有机酸,在酸性条件下 (pH4.5)可使大分子的杂蛋白沉淀. • 后加硫酸铵使抗体沉淀.
• • • • • 成本高，步骤较简单。 抗体回收率低。 抗体纯度高，适合于各种标记。 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 需要自动收集器。
5、凝胶过滤法(分子筛)

•
原理
将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经 路径的差异,使不同分子质量的组分分离. 大分子物质直接从凝胶颗粒外通过，走得快；小 分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来，走得慢。 适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD)
•
• •
带负电荷 的被吸附上
带负电荷少 的先被置换
带负电荷多 的后被置换
-
- -+ -
-
+
+ +
+
-
连续梯度洗脱:
NaCl Tris
梯度混合仪
阶段洗脱:
离子强度
倒入一定浓度的NaCl溶液
T
蛋白浓度
通过离心来分离
T

• •
主要步骤
先用硫酸铵沉淀抗体，粗提； 将样品过柱； 洗去没有结合的物质； 用梯度NaCl溶液洗脱，等量收集洗脱液； 紫外分光光度计测量，保留A280值明显升高的样品； 汇集样品，浓缩，测定浓度。
1
Ag
2 3
4
1 Ag
B1
4
3
B2 B3 B4 多克隆抗体
2
B3
B3
B3
B3
单克隆抗体
1、单克隆抗体的特点
特异性强，具有抗原结合位点的专一 性。（不是抗原的专一性！） 因结合位点的单一性，有时不易捕捉 抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产 生凝集反应或沉淀反应。 抗体的性质相同，容易纯化、标记。
不要剪毛）
• • • •
•
加强免疫 间隔2-4周,可进行多次 0.5ml抗原(蛋白量减半) 0.5ml佛式不完全佐剂(IFA) 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射
• • •
•
免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价 酶联法：1:104以上，能达到1:106。 免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64 效价达到要求的可放血制备血清 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)
抗体的制备及应用
一、抗体的一些基本概念

单克隆抗体 (Monoclonal Antibody,McAb) 单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体
多克隆抗体 (Polyclonal Antibody) 多个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
抗原（antigen ，Ag）
表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）

脑垂体分泌的一些激素：
hFSH 促卵泡激素 hLH 促黄体生成素
α β
α
β
hTSH 促甲状腺激素 hCG
α
β α β
#绒毛膜促性腺激素
单克隆抗体有交叉反应是由于不 同的抗原上有完全相同的表位（100% 的交叉反应）,或有相似的表位（不同 程度的交叉反应）。
产生凝集反应的原理
2 1
3 1 1
1

• •
主要步骤
在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀； 4℃高速离心,弃上清,溶解沉淀； 可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度: 50%饱和度: 0.313g/ml 45%饱和度: 0.277g/ml 40%饱和度: 0.243g/ml 最后一次离心后,用少量PBS溶解沉淀,透析， 测定浓度。
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特点
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主要步骤
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• • •
将腹水或血清处理后上柱,样品要浓； (可用G-200，柱子要长，80-100cm) 待样品入柱后,用缓冲液过柱； 等量收集洗脱液,测定洗脱液的A280值。 收集第一峰。
特点 • 成本高，步骤较简单。 • 抗体回收率较高，分离条件缓和，抗 体活性不受影响。 • 抗体纯度较高。 • 需要自动收集器。
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• • •
特点
• 成本较低，步骤较简单。 • 抗体回收率较高。 • 抗体纯度较高，电泳后可见少量杂带，适 合于各种标记。 • 纯化后抗体体积大，需要浓缩。 • 需要冷柜，自动收集器。
4、亲和层析法

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原理
利用蛋白质之间的特异性结合 （抗体-抗原，受体-配体） 将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配 的物质。 洗脱一般采用改变pH值的方法
取血测效价： 加强免疫两次或三次以后的第7天取血。 放血制备血清： 最后一次免疫后7-10天放血。 (在三角瓶中加一些生理盐水，放血放置一段 时间，凝固，吸取血清，离心，分装，冻存)

3) 如何免疫兔子
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2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20g，大鼠200g） 基础免疫 0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原) 0.5ml佛式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml） 制备抗原-佐剂乳化液 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意
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葡萄球菌A蛋白
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(staphylococcal protein A,SPA) 金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白 分子量42000,等电点pH5.1 可与大多数动物Ig的Fc段结合 一个SPA分子有4个相似的活性部位 与IgG的结合最强,与IgM,IgA的结合较差
特点