超薄切片技术原理篇.
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(3)机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避 免牵拉、挫伤与挤压。 (4)操作最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的 活性，防止细胞自溶。 (5)取材部位要准确。 1.2 取材方法： 将取出的组织放在洁净的韧性较大的纸上， 滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片成 “拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊 子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果 组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗 几遍，然后再切成小块固定。
5.5.2超薄切片的步骤包括： (1)安装包埋块； (2)安装玻璃刀； (3)调节刀与组织块的距离； (4)预切片； (5)换切片刀重新调节调节刀与组织块的距离； (6)水槽液面高度与灯光位置； (7)调节切片厚度及切片速度，切片； (8)将切片捞在有支持膜的载网上。
5.5.3超薄切片厚度的判断
2 固定
2.1 固定的目的 是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结 构保持生活状态，并且牢固地固定在它们原来所 在的位置上。 2.2 固定的方法 有物理法和化学法两大类。 物理法系采用冰冻、干燥等手段来保持细胞结 构； 化学法是用一定的化学试剂来固定细胞结构。 现通常使用化学法对组织或细胞进行固定。
4 渗透和包埋
4.1渗透 渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水 剂的过程，这种包埋剂在单体状态时(聚合前)为液 体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，并经加 温后，能聚合成固体，以便进行超薄切片。 目前常用的包埋剂是环氧树脂(epoxy resin)。环 氧树脂是一类高分子聚合物，它的分子中含有两种 反应基团，即环氧基和羟基。当加入酸酐类时，树 脂分子中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥 连接，这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂， 它们参与交联反应，并被吸收到树脂链中。常用的 硬化剂有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸 酐，简称DDSA)、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐(或叫 六甲酸酐，简称MNA)及顺丁烯二酸酐等。
当加入胺类时，就引起末端环氧基相连，形 成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端相接 的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂有 2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二 乙基苯胺及乙二胺等。为了改善包埋块的切割性 能，某些环氧树脂包埋剂配方中还加有增塑剂， 使包埋块具有适当的韧性。常用的增塑剂为邻苯 二甲酸二丁酯(简称DBP)。 4.2包埋 包埋操作： 常规将组织块包埋在多孔橡胶包 埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小时)、 60℃(24－36小时)烤箱内加温，即可聚合硬化， 形成包埋块。
超薄切片技术
河北大学细胞生物学
由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本 切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种 薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是5070nm。 在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术 是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制 作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、 固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等 步骤。
玻璃刀用制刀机制作。制好玻璃刀后，要 围绕刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮 在水面上。水槽有塑料水槽和胶布水槽两种。 塑料水槽有固定的形状，可反复使用。胶布水 槽是临时用胶布或专用塑料条制作的。装好水 槽后，用熔化的石蜡封固接口，防止漏水。 5.4载网和支持膜. (1) 载网 电镜中使用的载网有铜网、不锈钢网、镍 网等，一般常用铜网。载网为圆形，直径3mm。 网孔的形状有圆形、方形、单孔形等。网孔的 数目不等，有100、200、300目等多种规格， 可根据需要进行选择。
(2)戊二醛 ( C5H8O2) 戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内 质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和 细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的 活力，长时间的固定(几周甚至1～2个月)不会使 组织变脆。缺点是不能保存脂肪，没有电子染色 作用，对细胞膜的显示较差。 组织块固定常规采用戊二醛—锇酸双重固定 法。分前固定和后固定，中间用磷酸缓冲液漂洗。 前固定用2.5%戊二醛固定2小时以上、后固定用 1%锇酸固定液固定1～ 2小时，pH7.2～7.4。固 定完毕，用缓冲液漂洗20分钟后进行脱水 。
(2)切片染色 预先取一个清洁的培养皿，将石蜡溶解制 作成蜡板，然后滴数滴染液于蜡板上，用镊子 夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使 载网浮在液滴上，盖上培养皿，染色10～20分 钟。载网从染液中取出后，必须尽快用蒸馏水 清洗干净。 在染色过程中，铅染液容易与空气中的二 氧化碳结合形成碳酸铅颗粒，而污染切片。因 此，在保存和使用染液时，要尽量减少与空气 的接触。为防止铅沉淀污染，可在培养皿内放 置氢氧化钠颗粒，以吸收空气中的二氧化碳。
干涉色
暗灰色 灰色 银色 金色 紫色
厚度
＜40nm 40nm～50nm 50nm～70nm 70nm～90nm 80nm～150nm
6 超薄切片的染色
未经染色的超薄切片，反差很弱。因此，要 进行染色处理，以增强样品的反差。 一般是用重金属盐与组织细胞中某些成分 结合或被组织吸附来达到染色的目的。重金属 的原子对电子束形成散射，从而提高图象的反 差。 常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅。染色 方法有两种： (1)组织块染色 在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用70% 乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小 时以上，或在冰箱中过夜。
(2) 支持膜的制备 挑选并清洗好载网之后，要在载网上覆 盖一层薄膜，这层薄膜称支持膜，厚度为 10nm～20nm。对支持膜的要求是透明无结 构，并能承受电子束的轰击。常用的支持 膜有火棉胶膜及聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar 膜)，一般采用后者。
5.5超薄切片机 超薄切片需用超薄切片机进行。 5.5.1超薄切片机分类 根据推进原理不同，将超薄切片机分为两大类： （1）机械推进式切片机，用微动螺旋和微动杠 杆来提供微小推进； （2）热胀冷缩式切片机，利用金属杆热胀或冷 缩时产生的微小长度变化来提供推进。
超薄切片主要步骤
取材、分割 固定 脱水 渗透、包埋 超薄切片 超薄切片染色
1 取材、分割
1.1 取材、分割的基本要求 组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处 理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现 象。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使 细胞的微细结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽 可能保持生前状态，必须做到快、小、准、冷。 (1)动作迅速，组织从活体取下后应在最短时间内 (争取在1分钟内) 投入2.5%戊二醛固定液。 (2)体积要小，一般不超过0.5mm×0.5mm×0.5mm。 也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为 固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部 将不能得到良好的固定。
3 脱水
为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必 须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和 水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用 的脱水剂是乙醇和丙酮。 急骤的脱水会引起细胞的收缩，因此，脱 水应梯度进行： 15% 乙醇15分钟，30%乙醇 15分钟，50%乙醇15分钟， 70% 乙醇15分钟， 85%乙醇15分钟，95%乙醇15分钟，100%乙醇 １0分钟(二次)。游离细胞可适当缩短脱水时间。 过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使 样品发脆，造成切片困难。
半薄切片进行光学显微镜观察的目的： (1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察 的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去 其余部分。 (2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和 电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包 埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金 字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度 为0.2mm～0.3mm。 5.3制刀 超薄切片使用的刀有两种：一种是玻璃刀， 另一种是钻石刀。由于玻璃刀价格便宜，使用 者较多。制刀用的玻璃为硬质玻璃，厚度为 5mm～6.5mm。
2.3常用固定剂有: (1)四氧化锇 (OsO4) 是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和 力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良 好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应 使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定 脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白 稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应， 但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化 锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定 的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为 1-2小时。
包埋操作中应注意以下几点： (1)所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中； (2)所用器皿应烘干； (3)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； (4)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡； (5)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎； (6)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干 净。
5 超薄切片
5.1修块 一般用手工对包埋块进行修整。将包埋块夹在 特制的修块器上或拿在手中，在明亮处或放在解 剖镜下，用什锦锉或锋利的刀片先锉或削去表面 的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水 平面成45度的角度削去包埋剂，修成锥体形。 5.2半薄切片定位 利用超薄切片机切厚度为1μm-10μm的切片，称 厚切片或半薄切片。将切下的片子用镊子或吸管 转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，加温， 使切片展平，干燥后经甲苯胺蓝染色，光学显微 镜观察定位。
(3)机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避 免牵拉、挫伤与挤压。 (4)操作最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的 活性，防止细胞自溶。 (5)取材部位要准确。 1.2 取材方法： 将取出的组织放在洁净的韧性较大的纸上， 滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片成 “拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊 子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果 组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗 几遍，然后再切成小块固定。
5.5.2超薄切片的步骤包括： (1)安装包埋块； (2)安装玻璃刀； (3)调节刀与组织块的距离； (4)预切片； (5)换切片刀重新调节调节刀与组织块的距离； (6)水槽液面高度与灯光位置； (7)调节切片厚度及切片速度，切片； (8)将切片捞在有支持膜的载网上。
5.5.3超薄切片厚度的判断
2 固定
2.1 固定的目的 是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结 构保持生活状态，并且牢固地固定在它们原来所 在的位置上。 2.2 固定的方法 有物理法和化学法两大类。 物理法系采用冰冻、干燥等手段来保持细胞结 构； 化学法是用一定的化学试剂来固定细胞结构。 现通常使用化学法对组织或细胞进行固定。
4 渗透和包埋
4.1渗透 渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水 剂的过程，这种包埋剂在单体状态时(聚合前)为液 体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，并经加 温后，能聚合成固体，以便进行超薄切片。 目前常用的包埋剂是环氧树脂(epoxy resin)。环 氧树脂是一类高分子聚合物，它的分子中含有两种 反应基团，即环氧基和羟基。当加入酸酐类时，树 脂分子中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥 连接，这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂， 它们参与交联反应，并被吸收到树脂链中。常用的 硬化剂有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸 酐，简称DDSA)、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐(或叫 六甲酸酐，简称MNA)及顺丁烯二酸酐等。
当加入胺类时，就引起末端环氧基相连，形 成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端相接 的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂有 2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二 乙基苯胺及乙二胺等。为了改善包埋块的切割性 能，某些环氧树脂包埋剂配方中还加有增塑剂， 使包埋块具有适当的韧性。常用的增塑剂为邻苯 二甲酸二丁酯(简称DBP)。 4.2包埋 包埋操作： 常规将组织块包埋在多孔橡胶包 埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小时)、 60℃(24－36小时)烤箱内加温，即可聚合硬化， 形成包埋块。
超薄切片技术
河北大学细胞生物学
由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本 切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种 薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是5070nm。 在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术 是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制 作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、 固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等 步骤。
玻璃刀用制刀机制作。制好玻璃刀后，要 围绕刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮 在水面上。水槽有塑料水槽和胶布水槽两种。 塑料水槽有固定的形状，可反复使用。胶布水 槽是临时用胶布或专用塑料条制作的。装好水 槽后，用熔化的石蜡封固接口，防止漏水。 5.4载网和支持膜. (1) 载网 电镜中使用的载网有铜网、不锈钢网、镍 网等，一般常用铜网。载网为圆形，直径3mm。 网孔的形状有圆形、方形、单孔形等。网孔的 数目不等，有100、200、300目等多种规格， 可根据需要进行选择。
(2)戊二醛 ( C5H8O2) 戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内 质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和 细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的 活力，长时间的固定(几周甚至1～2个月)不会使 组织变脆。缺点是不能保存脂肪，没有电子染色 作用，对细胞膜的显示较差。 组织块固定常规采用戊二醛—锇酸双重固定 法。分前固定和后固定，中间用磷酸缓冲液漂洗。 前固定用2.5%戊二醛固定2小时以上、后固定用 1%锇酸固定液固定1～ 2小时，pH7.2～7.4。固 定完毕，用缓冲液漂洗20分钟后进行脱水 。
(2)切片染色 预先取一个清洁的培养皿，将石蜡溶解制 作成蜡板，然后滴数滴染液于蜡板上，用镊子 夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使 载网浮在液滴上，盖上培养皿，染色10～20分 钟。载网从染液中取出后，必须尽快用蒸馏水 清洗干净。 在染色过程中，铅染液容易与空气中的二 氧化碳结合形成碳酸铅颗粒，而污染切片。因 此，在保存和使用染液时，要尽量减少与空气 的接触。为防止铅沉淀污染，可在培养皿内放 置氢氧化钠颗粒，以吸收空气中的二氧化碳。
干涉色
暗灰色 灰色 银色 金色 紫色
厚度
＜40nm 40nm～50nm 50nm～70nm 70nm～90nm 80nm～150nm
6 超薄切片的染色
未经染色的超薄切片，反差很弱。因此，要 进行染色处理，以增强样品的反差。 一般是用重金属盐与组织细胞中某些成分 结合或被组织吸附来达到染色的目的。重金属 的原子对电子束形成散射，从而提高图象的反 差。 常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅。染色 方法有两种： (1)组织块染色 在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用70% 乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小 时以上，或在冰箱中过夜。
(2) 支持膜的制备 挑选并清洗好载网之后，要在载网上覆 盖一层薄膜，这层薄膜称支持膜，厚度为 10nm～20nm。对支持膜的要求是透明无结 构，并能承受电子束的轰击。常用的支持 膜有火棉胶膜及聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar 膜)，一般采用后者。
5.5超薄切片机 超薄切片需用超薄切片机进行。 5.5.1超薄切片机分类 根据推进原理不同，将超薄切片机分为两大类： （1）机械推进式切片机，用微动螺旋和微动杠 杆来提供微小推进； （2）热胀冷缩式切片机，利用金属杆热胀或冷 缩时产生的微小长度变化来提供推进。
超薄切片主要步骤
取材、分割 固定 脱水 渗透、包埋 超薄切片 超薄切片染色
1 取材、分割
1.1 取材、分割的基本要求 组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处 理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现 象。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使 细胞的微细结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽 可能保持生前状态，必须做到快、小、准、冷。 (1)动作迅速，组织从活体取下后应在最短时间内 (争取在1分钟内) 投入2.5%戊二醛固定液。 (2)体积要小，一般不超过0.5mm×0.5mm×0.5mm。 也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为 固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部 将不能得到良好的固定。
3 脱水
为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必 须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和 水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用 的脱水剂是乙醇和丙酮。 急骤的脱水会引起细胞的收缩，因此，脱 水应梯度进行： 15% 乙醇15分钟，30%乙醇 15分钟，50%乙醇15分钟， 70% 乙醇15分钟， 85%乙醇15分钟，95%乙醇15分钟，100%乙醇 １0分钟(二次)。游离细胞可适当缩短脱水时间。 过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使 样品发脆，造成切片困难。
半薄切片进行光学显微镜观察的目的： (1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察 的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去 其余部分。 (2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和 电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包 埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金 字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度 为0.2mm～0.3mm。 5.3制刀 超薄切片使用的刀有两种：一种是玻璃刀， 另一种是钻石刀。由于玻璃刀价格便宜，使用 者较多。制刀用的玻璃为硬质玻璃，厚度为 5mm～6.5mm。
2.3常用固定剂有: (1)四氧化锇 (OsO4) 是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和 力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良 好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应 使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定 脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白 稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应， 但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化 锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定 的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为 1-2小时。
包埋操作中应注意以下几点： (1)所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中； (2)所用器皿应烘干； (3)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； (4)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡； (5)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎； (6)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干 净。
5 超薄切片
5.1修块 一般用手工对包埋块进行修整。将包埋块夹在 特制的修块器上或拿在手中，在明亮处或放在解 剖镜下，用什锦锉或锋利的刀片先锉或削去表面 的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水 平面成45度的角度削去包埋剂，修成锥体形。 5.2半薄切片定位 利用超薄切片机切厚度为1μm-10μm的切片，称 厚切片或半薄切片。将切下的片子用镊子或吸管 转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，加温， 使切片展平，干燥后经甲苯胺蓝染色，光学显微 镜观察定位。