免疫原和抗血清的制备

亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力
抗原—抗体 受体—配体
电泳法：
利用分子量和电荷量不同进行分离
（三）纯化抗原的鉴定
蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法
分子量测定：பைடு நூலகம்DS-PAGE、凝胶过滤
纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电 泳、等电聚焦、高效液相层析 免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA
第三章 免疫原和抗血清的制备
第一节 免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体 或致敏淋巴细胞，并能与抗体或致敏淋巴细胞 发生反应的物质 颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫 可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸
抗原的制备对免疫学技术的意义： 制作诊断试剂的需要 制备抗体的需要
（二）可溶性抗原的纯化
超速离心法：根据抗原比重特点进行分离 差速离心法－低速和高速离心交替进行 适用用于分离大小差别较大的抗原：大分子抗原 （IgM(800kD)、C1q(410kD)),小分子抗原（载脂蛋白A28.3kD) 特点：方法较简单，但分辨率不高，沉淀系数在同一个数量 级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗 制品提取。 密度梯度离心法－区带离心法 离心时先将样品溶液臵于一个由梯度材料（蔗糖、甘油）形 成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于 梯度柱中 可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率
引力，是蛋白质溶解度降低，蛋白质聚集而沉淀。 特点：分辨能力比盐析法高，溶剂容易除去且可回收， 沉淀的蛋白质不需要脱盐处理，缺点是有机溶剂易使蛋白 质或酶变性，常采用降低温度的方法进行有效控制
聚合物沉淀法：聚乙二醇，能够破坏蛋白质分子表
面的水化层而发生沉淀,蛋白分子量越大需要的PEG
浓度越低, PEG浓度在3％～4％时沉淀免疫复合物，
选择性沉淀法：根据蛋白质理化特性差异 核酸去除法：氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素
盐析法：高浓度盐离子在蛋白质溶液中与蛋白质竞争水分子，
破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质从液体中沉淀出来。不同蛋 白质在不同盐浓度中有不同的溶解度，33% -50%硫酸铵
特点：方法简单、有效，不影响抗原活性；盐析法提纯
的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化 有机溶剂沉淀法：降低溶液的电解常数，增加蛋白质的静电
抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合
强度 用亲和常数Ka表示(表示1mol抗体稀释至多少升，才能使抗原-抗 体结合下降50%。 单位为稀度单位（LM-1） Ka值高（109～12L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度
第五节 抗血清的纯化
抗原免疫动物制备的抗血清是成分复
生物制剂（本身具有免疫原性） :处理改造的细菌及代谢产物，如卡 介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及CTB、LPS和类脂A、胞壁酰二肽等；细 胞因子及热休克蛋白 用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细
胞因子、热休克蛋白
常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)
动物个体必须适龄、健康、体重合适 抗原来源与动物种属关系远的
一、免疫动物的选择
抗原的性质：
蛋白质抗原对大部分抗原皆适用，常用羊、兔
有些物质动物体内有类似物质或者蛋白抗原对这些动物免疫原 性差，如IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶对山羊，免疫后 不出现抗体。 抗血清用量和要求：R型血清（家兔）：抗原抗体反应比例合
柱
二、抗血清的保存
2℃～8℃保存：短期保存
冰冻保存：保存5年
真空干燥保存：保存5～10年
多克隆抗体的实际意义： 预防：治疗感染性疾病（人工被动免疫）
如：破伤风抗毒素血清（副作用是超敏反应）
诊断：肥大氏反应（诊断伤寒、副伤寒）
抗血清的有点：来源广，制备容易
抗血清的缺点：
特异性不高，容易发生交叉反应
离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂（带有离子基团）：在惰性载体上引入带有 电荷的活性基团即离子交换剂 离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂 阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换
增加离子强度（增 加介导常数）或减 少pH(减少蛋白质电 荷），使蛋白质从 离子交换剂上解吸 附
产量有限 免疫原弱的抗原很难产生抗体
适范围宽,适用于诊断。H型血清（马）：抗原抗体反应比例合
适范围窄，适用于免疫治疗。
二、免疫方法
免疫原的剂量：由免疫原性的强弱、免疫动物种的 个体状态、免疫时间决定。
中间剂量范围内，免疫原剂量增加可获得高效价抗体 高特异性抗体：低剂量短程免疫 高效价抗体：高剂量长程免疫
免疫间隔时间
第一次和第二次间隔10～20天，三次及以后间隔7～10天
杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存 在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是 除去这些不相关成分，防止抗血清中其他 杂抗体干扰试验结果。
盐析法：硫酸铵盐析法提取γ球蛋白 离子交换层析法：QAE-sephadex带正电荷，IgG带正电荷。
亲和层析法：纯化抗原或SPA交联Sepharose 4B制成亲和层析
免疫途径
皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结 颗粒性抗原选择静脉免疫
三、动物采血法
颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊
心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡
静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊
第四节 抗血清的鉴定和保存
一、抗血清的鉴定
抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法
抗体效价的鉴定：凝集试验 、双向免疫扩散试验、ELISA 抗体纯度的鉴定：SDS-PAGE 、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲和性的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验
二、佐剂的作用机制
改变抗原物理性状，延缓其降解和排除，更有效刺激免疫系统。
刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力。 刺激淋巴细胞增殖和分化。 改变抗体的产生类型及诱导迟发超敏反应
一、免疫动物的选择
我要制备抗人HSP70抗体，我不能选择什么样动物？ 我要制备抗鸡IgG抗体，我不能选择什么样动物？
6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～ 15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突
出的应用是用3％～4％的PEG沉淀免疫复合物，未结
合的抗原和抗体留在溶液中。按此原理设计了快速
测定比浊法和循环免疫复合物测定法。
层析法： 凝胶层析法：
利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质 进行分离
免疫原的制备流程 选 材 预 处 理 提 取 纯 化
细 胞 粉 碎
鉴 定
冷 藏 保 存
一、颗粒性抗原的制备
细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵
1.绵羊红细胞：配成 2％～5％的细胞悬液。 2.细菌免疫原：鞭毛抗原需甲醛处理；菌体抗 原应加温去除鞭毛抗原（100℃ 加热2-2.5小时）。 3.虫卵：制备成悬液
二、可溶性抗原的制备和纯化
（一）可溶性抗原的制备
可溶性抗原包括蛋白质、脂多糖、核酸等，多来源于人 和动物的组织或细胞，需先将组织或细胞破碎，再提取和纯化， 才能获得所需的可溶性抗原（体液、组织液中抗原直接提取）。
组织抗原的制备
细胞的破碎
⑴ 酶处理法：溶菌酶溶解G- 菌的细胞壁；纤维素酶能溶解真 菌的细胞壁。作用条件温和，不易破坏内含物的成分，条 件可控。 ⑵ 反复冻融法（快冻慢溶）：冷冻使细胞内水分形成冰晶或 剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，适用于组织细胞破碎 ，对微生物作用差。 ⑶ 超声波破碎法：作用较温和，对大多数组织细胞破碎效果 好，重复性好，节省时间。对细菌和厚膜孢子效果差。 ⑷ 表面活性剂处理法：通过改变膜的通透性和渗透压，多用 于细菌破碎和提取核酸。
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与
抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原 的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质 称为免疫佐剂,简称佐剂（adjuvant）。
一、佐剂的种类
化合物（本身不具有免疫原性）:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、
弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸∶ 胞苷酸(poly I∶C)、脂质体