小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养的一种新方法

第30卷第1期2010年1月
国际病理科学与临床杂志 htt p://www .gjbl .net
I nternati onal Journal of Pathol ogy and ClinicalMedicine
Vol .30　No .1
Jan .　2010
收稿日期:2009-10-09 修回日期:2010-01-23作者简介:赵秀华,硕士研究生,主要从事成体干细胞的研究。

通讯作者:程腊梅,E 2mail:chenglamei2000@yahoo .com
基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2007CB947900);湖南省自然科学基金重点项目(08JJ3075)。

The work was supported by
Nati onal Key Basic Research and Devel opment Pr ojects (2007CB947900)and Key Pr ojects of Natural Science Foundati on of Hunan Pr ovince,P .R.China (08JJ3075).
・Arti cles ・
・论　著・
小鼠肝脏窦状内皮细胞分离和培养的一种新方法
赵秀华,罗彬,罗盘,程腊梅
(中南大学生殖与干细胞工程研究所,长沙410078)
[摘要]　目的:建立小鼠肝窦状内皮细胞(liver sinus oidal endothelial cells,LSEC )的分离培养方法,研究其生
物学特性。

方法:中性蛋白酶消化小鼠肝脏组织,Percoll 密度梯度离心分离消化后的细胞悬液,用内皮细胞筛选培养基及酶差异消化法纯化LSEC;免疫细胞化学染色检测LSEC 的表面标志,分析LSEC 的超微结构,观察D iI 荧光标记的乙酰低密度脂蛋白(acetylated 2l ow density li pop r otein,D iI 2Ac 2LDL )摄取能力,以体外成血管能力分析LSEC 的功能。

结果:分离纯化后的细胞呈典型鹅卵石样内皮细胞形态,这些细胞表达V III 因子,不表达CD31,CD90和
CK19,具有窦状内皮细胞特征性的窗孔结构;能摄取D iI 2Ac 2LDL,并有一定的成血管能力。

结论:建立了一种分离、
培养LSEC 的方法,为研究LSEC 的功能奠定了基础。

[关键词]　肝窦状内皮细胞;　条件培养基;　窗孔;　成血管结构;　小鼠doi:10.3969/j .issn .167322588.2010.01.001
A new m ethod for the isol a ti on and culture of
li ver si n uso i da l endotheli a l cells
Z HAO Xiuhua,LUO B ing,LUO Pan,CHENG La mei
(Institute of Reproductive and S te m Cell Engineering,Central South U niversity,Changsha 410078,China )
[Abstract]　O bjecti ve T o establish a method f or the is olati on and culture of mouse liver sinu 2s oidal endothelial cells (LSEC ),and t o study their bi ol ogical characteristics .M ethods L iver tissue fr om mouse was treated with a s oluti on containing 2U /mL dis pase,and then the cell sus pensi on was separated by Percoll density gradient centrifugati on .LSEC was purified by culturing in an endothelial cell selective mediu m and passaged with enzy me discrepancy digesti on .LSEC i m munophenoty p ic characteristicswere an 2alyzed by using cyt o 2i m munostaining .The ultrastructures of LSEC,the ability of up taking the acetylated l ow 2density li pop r otein (acetylated LDL ),and the vascular structures in vitr o were detected .Results The is olated cells showed the typ ical cobblest one mor phol ogy characteristic of endothelial cells .These cells ex 2p ressed fact or Ⅷbut not CD31,C D90,and CK19.They were able t o up take the acetylated l ow 2density li p 2op r otein and t o f or m vascular structure .The results of electr on m icr oscope sho wed that these cells possessed typ ical transcellular fenestrati ons with a sinus oidal origin .Conclusi on W e devel op a method f or the
1
第1期国际病理科学与临床杂志 htt p://第30卷
is olati on and culture of LSEC with ty p ical mor phol ogic and phenotyp ic characteristics.
[Key words]　liver sinus oidal endothelial cell;　conditi oned mediu m;　fenestratre;　vascular structures;　m ice
[I nt J Pathol Clin Med,2010,30(1):0001207]
肝窦状内皮细胞(liver sinus oidal endothelial cells, LSEC)是肝脏内所占比例最高的非实质细胞,约占肝非实质细胞总数的30%,位于肝窦腔与肝细胞之间[1]。

LSEC不仅在肝脏微循环、肝再生、肝移植缺血再灌注损伤及移植免疫耐受的诱导过程中发挥着非常重要的作用[2],而且在个体发育过程中为造血的发育提供了合适的微环境[3],因此其研究日益受到关注。

小鼠肝脏窦状内皮细胞的结构、免疫表型和功能特性与一般血管内皮细胞和内皮祖细胞均有较大差异,它们具有一般内皮细胞和内皮祖细胞所没有的窗孔结构、细胞间连结松散、内皮下缺少基底膜等结构[4]。

本文旨在建立小鼠肝脏窦状内皮细胞的分离、培养方法,为研究其生物学特性奠定基础。

1　材料与方法
1.1　试剂与材料
健康4周龄昆明白小鼠,雌雄不限,由中南大学实验动物中心提供。

磷酸盐缓冲液(P BS)、中性蛋白酶(dis pase)、0.05%胰酶2E DT A(T/E)、进口胎牛血清(fetal bovine seru m,F BS)购于美国Gibco公司;DA2 P I,纤连蛋白(fibr onectin),MC DB131,Percoll购于美国Sig ma公司;羊抗鼠CK19抗体、地塞米松购于美国Santa Cruz公司;EG M22购于Lonza公司;VEGF, bFGF,A lex488标记的山羊抗大鼠、F I T C标记的大鼠抗小鼠二抗购于美国I nvitr ogen公司;Aqua B l ock T M/ E I A/WB购于Eastcoastbi o公司;小鼠抗小鼠v W F抗体购于美国BD公司;大鼠抗小鼠C D31,小鼠抗小鼠CD90抗体购于美国Abca m公司。

AEC染色试剂盒为Ther mo公司产品;CO
2
培养箱为美国For ma Scien2 tific公司产品;光学显微镜、荧光显微镜、倒置相差显微镜为日本O ly mpus公司产品;流式细胞仪为美国BD公司产品;扫描电镜为日本电子株式会社(JE OL)产品。

1.2　LSEC的分离
分离方法参考文献[5],并加以改进。

75%酒精消毒小鼠,无菌条件下取出肝脏,P BS冲洗去除血液,
并去除包膜、血管、胆管、结缔组织。

将肝脏剪成1.7mm×1.7mm×1.7mm大小立方块后转移到培养皿中,加入2U/mL中性蛋白酶(dis pase)溶液,4℃消化过夜,用平头镊子充分挤压肝脏组织块以释放肝窦状内皮细胞,100目不锈钢筛网过滤,离心,于MC2 DB131培养液中重悬后离心洗涤细胞(2000r/ m in,10m in),最终细胞重悬于MCDB131培养液中。

在离心管中依次加入35%Percoll和细胞悬液,15000r/m in,4℃离心10m in,收集富含窦状内皮细胞的带,离心洗涤(2000r/m in,10m in),再次低速离心洗涤(600r/m in,5m in),细胞重悬,计数。

1.3　内皮条件培养基的制备
小鼠骨髓内皮细胞(中南大学王绮如教授赠)培养于含10%F BS的I M DM中。

待细胞生长至汇合度达80%时,将培养基替换为I M DM继续培养,24 h后收集培养基,离心、过滤,滤液则为内皮细胞条件培养液。

将制备的内皮细胞条件培养液于-20℃冰箱储存备用。

1.4　LSEC的培养
将分离得到的细胞重悬于内皮细胞选择性培养基,以1×106/mL密度接种在6孔细胞培养板中, 37℃,5%CO2条件下,培养5h,去掉非贴壁细胞,贴壁细胞在内皮细胞选择性培养中继续培养。

培养7d后0.05%胰酶2E DT A消化,消化过程中基质细胞先于窦状内皮细胞收缩,待细胞开始收缩,立即终止消化,贴壁细胞用P BS洗2遍后,继续纯化培养。

每2天换液1次,胰蛋白酶消化传代。

内皮细胞选择性培养基为40%MCDB131,40%EG M22和10%小鼠骨髓内皮细胞条件培养液,其中含10%进口F BS, 1%L2谷氨酰胺,10ng/mL VEGF,10ng/mL bFGF, 1ng/mL地塞米松。

1.5　免疫细胞化学
将细胞接种于纤连蛋白(fibr onectin)包被的盖玻片上,待细胞贴壁生长至80%的汇合度时,P BS轻轻洗涤残留的培养基,4%多聚甲醛固定10m in, Trit onХ2100破膜10m in,加入小鼠抗小鼠v W F抗体2
第1期赵秀华,等:小鼠肝脏窦状内皮细胞分离和培养的一种新方法第30卷
(1∶50)室温孵育2h,P BS 洗涤,然后加入山羊抗小鼠二抗,孵育10m in,P BS 洗涤后,加入AEC 显色,倒置相差显微镜下观察;对于CD31,CK19,CD90表达的检测,细胞固定后用Aqua B l ock
T M
/E I A /WB 室
温封闭1h,分别加入大鼠抗小鼠CD31抗体(1∶50)、羊抗小鼠CK19抗体(1∶50)、小鼠抗小鼠CD90
抗体(1∶50),4℃孵育过夜后,P BS 洗涤3遍,约0.5h,加入A lex 488标记的山羊抗大鼠二抗(1∶1000)、F I T C 标记的大鼠抗小鼠二抗(1∶250)、F I TC
标记的牛抗山羊二抗(1∶250),室温孵育,P BS 洗涤3遍后,DAP I (1∶1000)复染细胞核2m in,激光共聚
焦显微镜下观察,摄相记录。

1.6　D iI 荧光标记的乙酰低密度脂蛋白摄取能力
检测
为检测细胞摄取乙酰低密度脂蛋白(acetylated 2l o w density li pop r otein,D iI 2Ac 2LDL )的能力,待细胞
贴壁生长汇合度达80%后,在细胞生长培养基中加入D iI 2Ac 2LDL 10μg/mL,37℃孵育4h,P BS 洗涤3次,4%多聚甲醛固定10m in,DAP I 复染2m in,荧
光显微镜下观察。

脐血来源的内皮细胞祖细胞作为阳性对照
[6]。

1.7　成血管能力检测
在96孔板中,每孔加入50μL 的12mg /mL Ma 2trige 胶,37℃孵育30m in 可形成半固体胶状物。

收
集生长状态良好的细胞,调整细胞浓度为1×105
/mL,在加入了Matrigel 胶的96孔板中,每孔加入200
μL (2×104
细胞)细胞悬液,37℃,5%CO 2饱和湿
度条件下培养,在不同的时间观察细胞成血管情况,并摄像记录。

脐血来源的内皮细胞祖细胞做阳性对照。

1.8　扫描电镜分析
细胞接种在盖玻片上,待生长至80%汇合度时,P BS 轻洗2次,2.5%戊二醛固定5h,用四氧化锇(O s O 4)脱水30m in,CO 2临界点干燥,离子溅射,Am ray 1000B 型扫描电镜(SE M )观察LSEC 的窗孔
结构。

2　结 果2.1　细胞的分离纯化2.1.1　肝窦状内皮细胞的分离
肝脏细胞悬液通过Percoll 密度梯度离心后可形成4个条带,最上层为白色的脂肪层,Percoll 分离液与上层交界部位形成的灰白色层为细胞碎片带,肝细胞、枯否氏细胞(Kupffer ’s cell,KC )分布在Percoll 分离液层,最下层沉淀为红细胞,交界部位与
红细胞沉淀之间为LSEC 细胞带。

2.1.2　窦状内皮细胞的纯化
经密度梯度离心后,收集的LSEC 细胞带的细胞在光学显微镜下为小圆形、大小均一,培养2h 后去掉非贴壁细胞,24h 后大部分贴壁细胞形成卵石样结构,细胞密度较低的区域可见纺锤形细胞。

随着培养时间延长,大部分贴壁细胞形态逐渐变为典
型的鹅卵石样结构(图1A )。

在细胞生长至80%汇合度时,利用0.05%胰酶/E DT A 消化传代,可见内皮样的鹅卵石细胞贴壁较牢,非内皮样的细胞先于内皮样细胞收缩脱离皿底,洗去消化下来的细胞,未消化的贴壁细胞在内皮细胞选择培养基中继续培养。

用同样的方法消化、传代,培养至第2代可得到均一的、呈克隆性生长的鹅路石样内皮样细胞层(图1B )。

细胞生物学特性的检测全部采用第3
代细胞。

图1　L SEC 的形态(×100)。

A:原代LSEC;B:第2代LSEC 。

F i g .1　M orphology of L SEC (×100).A:Pri m ary LSEC;B:Passage 2LSEC 。

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2.2　窦状内皮细胞的部分内皮细胞特性2.2.1　LSEC 免疫表型分析
收集生长状态良好的第3代贴壁细胞分析其表型特征。

免疫细胞染色结果显示,所有细胞均表达Ⅷ因子,但不表达内皮祖细胞和血管内皮细胞的表
面标志CD31,也不表达肝上皮细胞表面标志CK19
和基质细胞表面标志CD90(图2)。

上述结果表明,分离纯化后的第3代细胞为均一的内皮样细胞,没有基质细胞和肝细胞污染。

图2　L SEC 免疫表型分析。

A:Ⅷ因子免疫细胞化学染色(×400);B:CD31免疫荧光染色(CD31为绿色;DAP I 为蓝色)(×
200);C:CK19免疫荧光染色(CK19为绿色;DAP I 为蓝色)(×200);D:C D90免疫荧光染色(CD90为绿色;DAP I 为蓝
色)(×200)。

F i g .2　I mm unophenotype ana lysis of li ver si n uso i da l endotheli a l cells .A:Cells were labeled with fact or Ⅷby i m munocyt oche m i 2
cal staining (×400);B:Cells were double labeled for C D31(green )and DAP I (blue )(×200);C:Cells were double la 2beled for CK19(green )and DAP I (blue )(×200);D:Cells were double labeled for C D90(green )and DAP I (blue )(×200).
2.2.2　LSEC 功能分析
血管内皮细胞和内皮祖细胞均具有摄取D il 2Ac 2LDL 和在体外形成血管的能力。

本研究中,在第3代细胞培养体系中,加入D il 2Ac 2LDL 培养4h 后,在荧光显微镜下可见所有细胞均能摄取D iI 2Ac 2LDL,发出红色的荧光(图3)。

这些细胞在Matrigel
上也能迁移、出芽,形成毛细血管样的结构,但与内皮祖细胞(endothelial p r ogenit or cells,EPC )比较,其血管形成能力较弱(图4),EPC 在Matrigel 上4h 就能形成典型的血管样结构,而窦状内皮细胞仅表现为少数细胞聚集,10h 左右才可见部分细胞出芽,12h 才可见到明显的管状结构形成。

第1期赵秀华,等:小鼠肝脏窦状内皮细胞分离和培养的一种新方法第30
卷
2.2.3　LSEC 膜表面具有典型的窗孔样结构
肝窦是高度特化的不连续的血管结构,在窦状内皮细胞表面有特征性的窗孔结构。

本研究中,通
过扫描电镜观察到传代培养的第2代单层细胞表面具有大量跨膜的窗孔样结构(图5)。

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卷
图5　L SEC扫描电镜形态,显示出典型的窗孔结构。

F i g.5　Scann i n g electron m i croscope of L SEC show i n g the
typ i ca l round fenestrae(Bar=1μm).
3　讨 论
获得高纯度的SEC为研究肝脏的病理生理提供了有价值的工具。

目前,不同的实验室采用不同的方法分离纯化LSEC。

Knook等[7]首次用链霉蛋白酶灌注肝组织,以离心淘洗术分离纯化LSEC,但链霉蛋白酶可破坏SEC的表面受体,影响细胞质量,并且淘洗设备昂贵、操作程序复杂,难以推广应用。

应用胶原酶灌注肝脏组织及采用Percoll密度梯度离心分离LSEC[8],既能分离LESC,又能较好地保持细胞活性,但操作复杂。

结合文献报道的方法及前期黄畅等[9210]分离纯化骨髓、脐血内皮细胞的经验,本研究采用了体外机械切割、酶消化、Percoll 密度梯度离心方法分离肝脏窦状内皮细胞;采用快速贴壁、选择性培养基培养和酶差异消化的方法进一步纯化LSEC,可得到高纯度、呈克隆性生长的LSEC。

该方法不需特殊装置、操作简便。

在选择性培养基中除了基础培养基MCDB131和EG M22外,还加入了能促进肝窦状内皮细胞生长的VEGF[11]以及既能刺激内皮细胞生长又能抑制巨噬细胞和成纤维细胞生长的小鼠骨髓内皮细胞条件培养液[12213],因此分离的LESC在此培养体系中培养,没有其它细胞的污染。

窦状内皮细胞具有特殊的生物学特性。

LSEC 具有一般细胞所没有的细胞表面窗孔结构,而且其表面抗原的表达也不同于普通血管内皮细胞。

本研究中,分析了分离培养后第3代的LSEC生物学特性,扫描电镜下观察到LSEC表面具有大量窗孔结
构,直径大约在100nm左右,与窦状内皮细胞的特性一致[14]。

有关LSEC表面标志多年来一直存在争议。

Knolle等[15]报道LSEC没有CD31的表达,而Katz等[16]和Pusztaszeri等[17]发现LSEC既表达v W F也表达CD31,Scoazec等[18]报道LSEC仅表达v W F但不表达CD31。

Karrar等[19]报道LSEC可摄取D il2Ac2LDL。

这些表型检测结果的差异可能与取材时肝脏组织的生理、病理状态,细胞体外培养时间长短、培养体系以及细胞检测前透明化处理技术等有关[5,20]。

在本研究中,作者分离纯化的LSECⅧ因子染色为阳性,但不表达内皮细胞的表面标志CD31,能摄取D iI2Ac2LDL,与Scoazec等[18]报道的结果一致。

为了检测分离纯化后得到的LSEC的纯度,作者检测了间质细胞的表面标志CD90和肝上皮细胞的表面标志CK19在分离纯化后的细胞中的表达,发现这两种抗原的表达均为阴性,表明本研究建立的分离纯化LSEC的方法是可行的。

综上所述,作者成功地建立了分离纯化小鼠LSEC的方法,并且对其生物学特性进行了初步的研究,为进一步深入研究其功能奠定了基础。

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《国际病理科学与临床杂志》编辑部
2010年2月
7。