第15章 厌氧菌

厌氧菌的初步鉴定
菌 名 革兰染色
G－
形态及其他特征
脆弱类杆菌
两端钝圆着色深，中间色浅不均匀，有空泡，长短不一，标本有琥珀味 球杆菌，可见多形性，长短不一，紫外线照射发红色荧光，标本有恶臭 菌体细长，两头尖，紫色颗粒沿菌体长轴成双排列，标本有丁酸味 菌体细长，高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形 极小的革兰阴性球菌 球形或卵圆形，呈链状的小球菌，易染成阴性
致病条件与毒素
伤口需形成厌氧微环境
伤口窄而深（如刺伤），有泥土或异物污染 大面积创伤、烧伤，坏死组织多，局部组织缺血 有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染的伤口 无侵袭力，仅在局部繁殖，外毒素致病
对氧敏感的破伤风溶血毒素(tetanolysin) 质粒编码的破伤风痉挛毒素(tetanospasmin)
产气荚膜梭菌
艰难梭菌
G＋
G＋
粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，有荚膜
粗长杆菌，芽胞卵圆形或长方形，位于次极端
标本的分离培养
初代培养：厌氧菌的初代培养比较困难，不仅要 创造无氧环境，还要选择适当的培养基。 在培养基选择上应注意： 1.尽量使用新鲜培养基，2～4ｈ内用完； 2.使用前放入无氧环境，预还原处理24～48ｈ； 3.也可采用预还原灭菌法制备的培养基； 4.液体培养基应煮沸10min，驱除溶解氧，并迅 速冷却，立即接种。
紫单胞菌属
紫单胞菌属(Porphyromonas) 又称卟啉单胞菌 属。代表菌种是不解糖紫单胞菌。
革兰阴性杆菌或球杆菌，大小约1.5～ 3.5µm×0.8～1.5µm，两端钝圆，着色不均匀。 35～37℃厌氧培养3～5d可形成1～2mm圆形、凸 起、表面光滑、边缘整齐、棕色或黑色菌落。 维生素K1和氯化血红素可促进本菌生长及黑色 素的产生。
厌氧菌感染的临床特征
局部有气体产生为重要指征之一 发生在黏膜附近的感染 深部外伤如枪伤、人或动物咬伤后的继发感染 分泌物有恶臭或暗红血色或在紫外光下发出红色 荧光，或脓汁中有硫磺颗粒即为放线菌感染 某些抗生素治疗无效的感染 革兰染色着色不均、形态奇特、呈明显多形性； 或镜检见细菌而需氧培养为阴性者。
梭杆菌属
梭杆菌属 （Fusobacterium） 是临床常见的革兰 阴性无芽胞厌氧杆 菌，形态细长，两 端尖细如梭 。
坏死梭杆菌形态
致病性
坏死梭杆菌是毒力很强的梭杆菌，常引起急性 扁桃体炎，有时并发单核细胞增多症，是儿童 和青年人扁桃体周围脓肿中最常分离到的厌氧 菌。局部症状还包括颈间隙感染和颈静脉脓毒 性血栓静脉炎，尚可引起胸膜渗出性脓胸、增 生性转移脓肿和菌血症。
培养特性
专性厌氧，在梭菌培养基（cd基）上37℃培养48h，菌落 直径2～4mm，扁平、灰白色、边缘疏松呈羽毛状，伴β 溶 血。在庖肉培养基中，肉渣部分消化，微变黑，有少量气 体。生成甲基硫醇及H2S，导致培养物有腐败性恶臭
破伤风杆菌在厌氧平板上羽毛状菌落
左侧：在疱肉培养基上生长 右侧：阴性对照
培养方法
通过物理、化学或生物学等方法，创造一种 无氧的环境 常用的厌氧培养法： 1.厌氧罐法 2.气袋法 3.厌氧手套箱 4.厌氧工作站
结果观察
厌氧菌的初代培养生长较慢，故应在48ｈ后才 能初步观察 观察时应注意： 1.厌氧菌在对数生长期对氧非常敏感，故在 培养的48ｈ内不应使细菌暴露于空气中 2.标本镜检阳性，但培养48ｈ却无菌生长， 应继续培养5～7ｄ。
标本的接种
初代培养应同时接种固体、液体两种培养基， 且每份标本应同时接种3个平板，分别置有氧、 无氧和含5~10%CO2环境培养。 为了便于在混合培养物中发现厌氧菌，一般将 标本分3区划线接种于平板上，在1、2区交界 处，贴一张含5μg/片的甲硝唑纸片，如纸片 周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌存在。
标本的检查方法
实验室收到标本应在20～30min内处理完毕，最迟不 超过2h。如不能及时接种，应将标本保存于室温（冷 藏对厌氧菌有害）。 直接检查：实验室收到标本应仔细观察其性状，包括 气味、是否脓性、带血或黑色坏死组织、硫磺样颗粒 及紫外灯下有无荧光等。 除血液外，各种标本均须直接涂片作革兰染色镜检， 发现染色不均，形态奇特者常为厌氧菌的表现。
韦荣球菌属
韦荣球菌属细菌形态相似，为革兰阴性球菌。直径 0.3～0.5μ m，多排列成对、近似奈瑟球菌。无鞭 毛、无芽胞。 专性厌氧，血琼脂平板上生长良好，培养48h 后， 形成直径1～2mm圆形、凸起、灰白色或黄色混浊、 不溶血菌落；在硫乙醇酸盐肉汤中混浊生长，产生 小气泡。 新鲜培养物立即置紫外线下照射，菌落可显红色荧 光，接触空气后荧光消失。 生化反应不活泼，不分解糖类，还原硝酸盐。
厌氧菌感染的条件
局部组织的氧化还原电势降低：如血管损伤、烧伤、 动脉硬化、肿瘤压迫、组织坏死等，可造成局部组织 的缺血、缺氧等。 皮肤黏膜屏障被破坏：如大面积外伤伴有需氧菌感染， 为厌氧菌感染提供了条件。 机体免疫功能下降：如接受免疫抑制剂、放疗或化疗 的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病及老人、婴幼儿、 早产儿等。 菌群失调：长期或大量应用广谱抗菌药物无效的患者， 均可诱发厌氧菌感染。
破伤风梭菌（C. tetani）
破伤风梭菌是梭菌属中常见 的一种芽胞杆菌，能引起破 伤风得名。 菌体细长，约为2.0～ 5.0×0.5～1.5μm 。有周 鞭毛，能运动，无荚膜。芽 胞正圆形大于菌体，位于菌 体顶端呈鼓槌状。 鞭毛
破伤风杆菌镜下形态（18 ～ 24h） 革兰染色
破伤风杆菌镜下形态（48h） 革兰染色
第五节
革兰阳性无芽胞厌氧杆菌
来自百度文库
革兰阳性无芽胞厌氧杆菌(anaerobic nonsporeforming Gram-positive bacilli) 有6个属，几十个菌种，临床常 见的有丙酸杆菌、优杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、蛛网菌 和放线菌。
它们多是人和动物皮肤、口腔、肠道等部位的重要生理菌 群，在体内起到调节和维持人体微生态平衡的重要作用。
第四节
革兰阴性无芽胞厌氧杆菌
这是一群不形成芽胞的厌氧杆菌，是人体正 常菌群的重要组成成员，部分菌株可作为条 件致病菌引起感染。 常见菌属有：类杆菌属 普雷沃菌属 紫单胞菌属 梭杆菌属
类杆菌属
类杆菌属(Bacteroides)是临床上 最重要的革兰阴性无芽胞厌氧杆 菌，临床标本中以脆弱类杆菌 （B.fragilis）最常见。 脆弱类杆菌为革兰阴性，大小为 (0.8～1.3μ m)×(1.6～8μ m)， 着色不均，两端钝圆而浓染，中 间不着色染色较浅似空泡。在陈 旧培养物或含糖的液体培养基中 呈明显多形性，无鞭毛、无芽胞， 多数有荚膜。
第二节
厌氧菌的检验
标本的采集与运送是否适当，对厌氧菌培养能否 成功至关重要。临床在进行厌氧菌培养前应与实 验室联系，以便实验室做好接种培养的准备。 须注意两点：①标本不能被正常菌群所污染； ②应尽量避免接触空气。 某些标本不适合做厌氧菌培养：如鼻咽拭子、痰 液、流出的脓液、阴道分泌物、粪便等。
第十五章
厌氧菌
郑州大学第一临床学院
冯羡菊
第一节
概
述
厌氧性细菌(anaerobic bacteria)指一 群在有氧条件下不能生长，必须在无氧条件 下才能生长繁殖的细菌。
厌氧菌的分类
分为两类： 一类为有芽胞厌氧菌，只有一个属，即梭菌属， 共有130个种，以芽胞形式存于体外。 另一类为无芽胞厌氧菌， 包括40多个属， 300 多个菌种和亚种；多为体内正常菌 群， 存在于皮肤、口腔、上呼吸道、肠道和泌尿生 殖道。易引起这些部位的内源性感染。
鉴定试验
形态与染色：不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同 时也为鉴定厌氧菌提供参考依据。 菌落性状：包括其形态、大小、色素、荧光及溶血等 快速鉴定：其原理是依据细菌在代谢过程中所产生的 胞外酶与少量生化基质迅速反应，能在4小时观察结 果，无需在厌氧环境下培养，只需用浓菌液即可。 其他：气液相色谱、PCR和基因探针等方法。
消化链球菌属
代表菌为厌氧消化链球 菌（P.anaerobius） 革兰阳性球形或卵圆形， 大小不等，菌体直径 0.3～1μ m，常成双或 呈短链状排列。无鞭毛， 无芽胞，无荚膜。
消化链球菌培养特性
专性厌氧，营养要求较高，需羊血和血清培养 基才能生长。在厌氧血平板上，菌落直径0.5～ 1mm、灰白色、凸起、不透明、边缘整齐，一般 不溶血，偶有甲型或乙型溶血。 生化反应不活泼，在硫乙醇酸钠液体培养基中， 呈颗粒状沉淀生长。在其平板上生化反应较为 明显，吐温-80可促进其生长。
次代培养和厌氧菌的确定
初代厌氧培养有细菌生长时，必须做耐氧试验 以确定是否为厌氧菌。 方法：从每个平板上挑取4~5个不同性状的菌 落，每个菌落分别接种3个平板（每个平板分 4~6个区，可同时做4~6个菌落的次代培 养）。分别放有氧、无氧和含5%~10%CO2 环境中培养48ｈ，如只在厌氧环境中生长的 细菌，即为厌氧菌。
产黑色素普雷沃菌 G－ 具核酸杆菌 坏死梭杆菌 韦荣球菌 消化链球菌 G－ G－ G－ G＋
乳酸杆菌
痤疮丙酸杆菌 放线菌 破伤风梭菌
G＋
G＋ G＋ G＋
细长无芽胞，有时多形性，标本有乳酸气味
排列呈X、Y、V或栅状，标本有丙酸气味 分枝呈棒状， X、Y、V或栅状排列，脓汁中的黄色颗粒呈琥珀酸气味 细长鼓槌状，极端芽胞，圆形
培养基的选择
根据镜检结果选择合适的培养基，常用的有 非选择性和选择性培养基两种。
非选择培养基：以牛心脑浸液及布氏肉汤为 基础，补充0.5%酵母浸出液，5μg/ml 氯化血红素、10 μg/ml维生素K1及 5%~10%的脱纤维血的强化血平板。几 乎能培养出所有的厌氧菌。
培养基的选择
常用的选择培养基: 1.七叶苷胆汁平板（BBE） 用于脆脆弱类杆菌 2.卡那万古冻溶血平板（KVLB） 可抑制大多数兼性 厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期产生黑色素 3.FS培养基 梭杆菌选择培养基 4.VS培养基 韦荣球菌选择培养基 5.CCFA培养基 艰难梭菌选择培养基 6.卵黄平板（EYA）和兔血平板 产气荚膜梭菌
它们的菌落、生化反应、菌体形态等都很相似，鉴定较难。 应用气液相色谱法（GLC），根据其代谢产物不同，可对 菌属做出初步判定。
第六节
梭状芽胞杆菌
梭状芽胞杆菌属（Clostridium）简称梭菌属，是 厌氧芽胞杆菌（anaerobic sporeforming bacilli） 的唯一菌属，有130个种。 革兰染色阳性，芽胞呈圆形或卵圆形，直径大于菌 体，位于菌体中央，极端或次极端，使菌体膨大呈 梭状。 本菌属细菌在自然界分布广泛，临床有致病性的主 要有破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌与艰难 梭菌等。
第三节
厌氧球菌
厌氧性球菌(Anaerobic cocci)是临床厌氧感染 的重要病原菌，约占临床厌氧菌分离株的25％ 主要包括革兰阳性:消化球菌属 消化链球菌属 革兰阴性:韦荣球菌属
消化球菌属
黑色消化球菌(Peptococcus niger)是消化 球菌属中唯一的菌种。 革兰阳性球菌。直径0.3～1.3μ m，单个、 成双、短链或成堆排列。无芽胞，无荚膜。 专性厌氧菌，生长缓慢，厌氧培养2～4天形 成黑色不溶血的小菌落。 标本黑色有臭味是该细菌感染的重要特点。
普雷沃菌属
普雷沃菌属(Prevotella)是从类杆菌属分出的 一个新菌属，代表菌种是产黑色素普雷沃菌 (P.melaninogenica)。 革兰阴性球杆状，大小约0.8～1.5µm×1.0～ 3.5µm，排列成双或短链，两端钝圆，有浓染 和空泡。
产黑色素普雷沃菌培养特性
专性厌氧菌，在厌氧平板上 2～3天培养后，菌落直径为 0.5～3mm，圆形、凸起、不 透明，许多菌株呈β -溶血。 菌落在紫外光（波长366nm） 照射下有砖红色荧光，逐渐 转为褐黑色和棕色菌落， 5～7天转为黑色菌落，色素 出现后荧光即消失。