时间分辨荧光免疫分析技术..

双抗体夹心法示意图
固相包被抗体
Eu
Eu
孵育
+
待测抗原
+
铕标记抗体
Eu
+
增强液
+
Eu
双抗原夹心法示意图
固相包被抗原 孵育
Eu
孵育
+
待测抗体
+
铕标记抗原
Eu
+
增强液
+
Eu
中和法示意图(回滴定法)
孵育
+
+
中和抗原 待测抗体
孵育
+
Eu
铕标记抗体
Eu
+ 增强液
+
Eu
Eu
小分子抗原竞争抑制示意图
固相包被二抗
时间分辨荧光免疫分析技术
王 征
达瑞抗体
标记免疫学分析技术发展历程

免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶免ELISA (Engvall, 1971) 金标免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 液相芯片(美国Luminex公司, 1997)
TBG、TG、TGAb、TPoAb 糖尿病系列：insulin、C-Peptide 生长激素：hGH 其他：Cortisol
肿瘤科检查
AFP、CEA、tPSA 、β2-MG 、hTG、 CA-242、CA-724 、 CA-50 、 fPSA 、 NSE 、 cyfra 211 、 CA-199、CA-125、 CA153 乙肝系列： HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 其他：HCV、HIV FSH、LH、hCG、Prolactin、Progesterone、SHBG 、β hCG 、 PAPP-A、Testosterone 、uE3、E2 贫血检查：（Ferritin、VitB12、叶酸） 产前筛查：hAFP/Free β-hCG 新生儿筛查：Neo. hTSH、Neo.T4、Neo.17α-OH-Prog
1984年， Hemmila确定了DELFIA(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成 为Wallac的专利技术


1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA 的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen
FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物，
碱性
DELFIA标记技术
通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光 分辨开来，使理论本底达到0
340nm激发光 第二个循环
荧 光
短 寿 命 荧 光
613nm长寿命荧光
0
400
800
1000
时间:(µs）
延迟时间
测值时间
激发光
发射光
荧 光 强 度
⑥电化学发光 ⑤时间分辨荧光
④化学发光
③酶联免疫 ②放射免疫 ①免疫荧光
标记免疫技术的理论检测灵敏度

放射免疫 酶联免疫 化学发光 时间分辨荧光 电化学发光
10-10-10-12 mol 10-9-10-10 mol 10-15 mol 10-18 mol 10-18 mol
一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）
传染病检查
妇产科检查 血液科检查 遗传科检查
标准品 铕标记物
Thanks
2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖

基本原理
三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy)
等，它们的荧光光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长 的特点
DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)
为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的NH2 连接。在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具 有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTAEu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的 配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地 放大 通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于 BCPDA 的可检测性不够理想，FIAgen 需要利用生物素亲合素信号放大来弥补BCPDA 检测灵敏度的不足

达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）
Wallac AutoDELFIA 1235
半自动 VICTOR2 1420
半自动 ANYTEST2000
DR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪
【粤食药管械（准）字2005第2400226】
达瑞公司开发的系列TRF试剂
内分泌科检查 甲状腺系列：T3、T4、FT3、FT4、TSH、
300
400 500 波长(nm)
600
Tb
Dy
Eu
Sm 发 射 光 强 度
0 200 400 500 600 发射光波长(nm)
TRFIA技术特点
极长的荧光衰退时间
铕：730000ns
Stokes位移大
铕：激发光340nm，发射光613nm
狭窄的发射峰
解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍
（Time-resolved fluorescence immunoassay）

背景介绍 基本原理 技术特点

反应模式
背景介绍
wk.baidu.com
1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini 和 Hemmila首次提出了建立 稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论

1983年，Soini 和 Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨 荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年， Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素 (hCG)进行了时间 分辨荧光免疫分析
+
一抗
孵育
孵育
+
待测抗原
+
Eu
铕标抗原
Eu
+ 增强液
Eu
+
Eu
时间分辨技术重点和难点

固定相（96孔板） 标准品 铕标记物


二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）
测试仪
目前的TRFIA测试仪：

国外仪器（Wallac公司<PerkinElmer>）
国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等)