蛋白质错误折叠

蛋白质的错误折叠
郑晓惠 10281034
生物物理学系
主要内容：
1 蛋白质的正常折叠及保护机制
2 蛋白质错误折叠与神经系统相关疾病
3 蛋白质错误折叠的机制
4 蛋白质错误折叠的致病机理
5 针对蛋白质错误折叠可采取的治疗途径
6 结语
一蛋白质的正常折叠及保护机制
根据分子生物学中心法则，生物遗传信息的传递是由DNA到RNA（转录）、RNA到蛋白质多肽链（翻译）、再由多肽链形成具有生物活性的蛋白质（折叠）进行的。

目前对前两个过程已有相当深入和清晰的了解，但对后者尚不十分清楚。

可以说蛋白质折叠是生物学中心法则中至今尚未解决的一个重大生物学问题。

蛋白质是生物体内一切功能的执行者。

具有完整一级结构的多肽链只有当其折叠形成正确的三维空间结构才能具有正常的生物学功能。

如果这种折叠过程在体内发生故障，形成错误的空间结构，不但将丧失其生物学功能，甚至会引起疾病。

在细胞内大多数天然蛋白质能自发的形成比较稳定的天然结构，或被配体和代谢因子所稳定。

但约10-20%新合成的多肽链需要分子伴侣的帮助才能正常折叠。

另外，约有20%新合成的多肽链不能形成正确的三维结构而被蛋白酶降解，包括由于错误转录和翻译形成的不完全蛋白质，翻译后受到化学损伤或其他因素引起的失活、去折叠或折叠错误的蛋白质。

在真核细胞中，多余的蛋白质主要通过泛肽化(ubiquittination)过程降解，见图1[3]。

分子伴侣实际上是生物克服细胞内大分子拥挤环境对蛋白质生物合成影响的进化产物。

分子伴侣的共同特征是参与催化、介导其他多肽链或寡聚体蛋白质分子的折叠与组装，但不是蛋白质最终结构的一部分。

它与靶蛋白的结合不具高度专一性，同一伴侣分子可促进多种氨基酸序列不同的多肽链折叠。

它只是分子折叠的协助者，本身并不含正确折叠所必须的构象信息，而是通过阻止非天然多肽内部或相互间的不正确作用而发挥效能。

至今为止发现的大多数分子伴侣属热休克蛋白的范畴。

小分子伴侣，如热休克蛋白40和70，以单体形式与核糖体上延伸中新生肽链上的疏水氨基酸短序列结合，防止新生肽链在未完成合成之前的错误折叠，抑制相邻肽链上的疏水氨基酸间相互作用而发生的聚集。

当一个结构域的多肽链合成完成，便与小分子伴侣解离，而折叠成为结构域。

有一些蛋白质的结构域折叠缓慢，当后续肽链合成时常以部分折叠中间体的形式存在，此时可有大量的疏水表面暴露，有增加聚集时风险。

这时就需要大分子伴侣的帮助，与中间体结合而抑制翻译后折叠过程中的聚集[4]。

所以，分子伴侣在保证蛋白质的正常折叠中有重要作用。

图1 原核细胞中保证蛋白质正确折叠的过程
二蛋白质错误折叠与神经系统相关疾病
体内确保蛋白质正确折叠的过程包括两步：一是识别错误，发现那些蛋白质受到了损伤；二是决定错误能否更正，能更正的蛋白质在分子伴侣的帮助下恢复正常结构，不能更正的通过蛋白酶降解后清除。

如果这一保护机制发生障碍，例如错误折叠的蛋白质所暴露的表面不能被分子伴侣或蛋白酶所识别，或形成聚合的速度大于被分子伴侣、蛋白酶识别的速度，则那些未被分子伴侣保护，又未被蛋白酶降解的错误折叠分子，就可能相互聚合，从而引起蛋白质构象病[3]。

目前蛋白质错误折叠与疾病的关系已成为分子生物学新的研究前沿。

到目前为止已发现有15-20种蛋白能发生病理性的聚合，形成淀粉样沉淀。

大量试验证明由朊病毒引起的神经退性变疾病是由于正常蛋白的错误折叠形成的致病蛋白-朊病毒蛋白(prion orotein PrP)在脑组织中累积而引起的，包括牛海绵状脑病（俗称疯牛病）、羊瘙痒病、人克雅氏病、震颤病和吉斯综合症等。

PrP由17种氨基酸，246个分子组成，有两种形式；细胞型PrP c和异常型PrP sc。

正常细胞中PrP c的序列以α螺旋结构为主, β折叠仅占11.9% 若PrP c中的α螺旋发生结构转换成β折叠, 则变成为异常型的PrP sc, 其结构中β折叠占43%。

PrP sc蛋白聚集沉积，引起病状并有传染性.。

如果在PrP sc蛋白中加入六氟异丙醇, 则β折叠重新转化为α螺旋, 同时积聚溶解并丧失传染性，见图2[3]。

另外, βAPP蛋白(β amyloid precursor protein)的剪切和结构转换为β淀粉样肽(β amyloid), 并以多肽链间的β折叠形成纤维状沉积物则与老年痴呆症的发生有关[2]。

帕金森氏病也可能是源于蛋白质的错误折叠。

在病人脑中有被称为Lewy小体的蛋白沉积物，包含有α-synuclein蛋白形成的纤维。

此外，还有亨丁氏舞蹈病和淀粉样蛋白病等也与蛋白质的病理性聚合有关。

很显然, 蛋白质的淀粉样化是许多“构象病”的直接原因。

认识导致蛋白质错误折叠的原因和途径，建立防止蛋白质错
误折叠的方法是防止和治疗这类疾病的关键。

图2 大肠杆菌中表达的重组人的PrP91-231片段从
α螺旋向β折叠结构的转化
三蛋白质错误折叠的机制和决定因素
蛋白质积聚往往由蛋白质的错误折叠所引起, 而蛋白质构象元件的结构转换是导致蛋白质错误折叠的主要原因。

许多研究表明，在各种神经退性变疾病中各种错误折叠蛋白形成的聚集体有相同的分子形式，见图3[1]。

一般而言，天然构象主要由α螺旋和无规结构组成，而错误折叠的构象富含β片层结构。

由于其不溶性和非结晶性质，进行高分辨的研究比较困难。

但最近用X线纤维衍射和固相核磁共振研究证实在神经退性变疾病的聚集体中富含β片层结构。

而Tau聚集物例外，其主要组成为α螺旋。

图3 神经退性变脑组织内的聚集物
已建立的AD淀粉样纤维的分子模型认为该纤维是由与纤维长轴垂直平行排列的β片层靠氢键连接而成的原纤维组成。

这表明在蛋白质的错误折叠和聚集中发生了多肽链较大的构象变化。

但尚不清楚是错误折叠引发了聚集，还是蛋白的低聚合引起了构象变化。

根据现有证据，很可能是轻度的构象变化导致了错误折叠中间体的形成，由于疏水部分的暴露而难溶于水性环境中。

这个不稳定的中间体通过与其它分子的相互作用，形成小的亚聚体而稳定，进一步发展形成淀粉样纤维，见图4[1]。

图4 蛋白质错误折叠的过程
改变溶液条件和蛋白序列的研究是了解产生聚集所需构象变化条件的有效方法，在AD 的研究中用的最多。

Aβ片段的研究表明氨基酸17-21间的内部疏水区域与Aβ的错误折叠和早期聚集有重要关系，提示Aβ聚集是由疏水相互作用驱动的。

PrP的研究也有相似结果，其106-126间的疏水片段与错误折叠关系最大。

虽然对α-synuclein蛋白纤维的形成过程还不太了解，但有证据表明其氨基端1-87的疏水部分有关键作用。

从上述情况可见, 具有β折叠结构的蛋白质容易形成积聚, 而纤维状的蛋白质积聚体中往往含有大量的β结构存在。

蛋白质由于突变或其他因素引起α螺旋向β折叠的转换或许是比较普遍的结构转换模式, 具有较广泛的生物学意义。

考察α螺旋和β折叠的结构特征, 发现β折叠往往含较多的非极性残基, 并埋在蛋白质内部形成疏水核心；而α螺旋通常是两性的, 亲水面位于表面, 疏水一侧朝向蛋白质内部[2]。

α/β的结构转换导致疏水核的暴露和亲水面的减少, 容易引起蛋白质分子间形成交叉β折叠结构(cross-β-sheet)，这可能是引起Aβ和prion等蛋白质分子间积聚的主要原因。

那么, 从热力学或动力学观点看, 究竟是什么内在因素引起这种α螺旋向β折叠的转换. 这或许是今后认识蛋白质结构转换和分子积聚本质的基础.
四蛋白质错误折叠的致病机理
神经退性变疾病的典型特点是选择性的神经元丢失、突触改变和神经元炎症。

但不同疾病脑内受累区域不同，而导致临床表现不同。

神经元丢失是程序性细胞死亡，既细胞凋亡(progressed cell death or apoptosis)所致，目前至少有三种假说解释这一现象，见图5[1]。

（1） 获得性毒性假说（the gain of toxic activity）
这个被广泛接受的假说认为，蛋白质的错误折叠和聚集使其获得了神经毒性。

直接证据是错误折叠的蛋白质在体外聚集可引起神经元的凋亡。

此学说关于蛋白质的神经毒性有4种解释，见图6[1]。

一是细胞外的聚集有可能通过与细胞特殊受体的相互作用，激活信号传导通道而导致凋亡。

二是细胞内的聚集引起纤维聚集因子的再生而损害细胞。

三是Aβ和PrP的神经毒性缘于离子通道形成所引起的膜破裂和去极化，改变了离子动态平衡和细胞信号传导的调节，导致细胞死亡。

四是蛋白质的聚集引起超氧负荷（oxidative stress）,通过产生自由基，引起蛋白质和脂质过氧化及细胞内钙浓度增加，线粒体功能障碍，而致细胞死亡。

图5. 错误折叠蛋白质的神经退性变机制图6. 错误折叠蛋白质的神经毒性机制
最近，组织学、生物化学和细胞生物学的研究对聚集物学说提出了质疑。

AD和PD病人脑组织的神经元病理分析表明含有Lewy小体和神经纤维缠结的神经元，在形态和生化方面比邻近细胞似乎更健康。

而在没有神经元丢失和AD或PD临床表现的人中也发现有淀粉样斑和lewy小体。

而且，在一些AD、TSH和HD的动物模型发现，在发生蛋白聚集前就可探测到脑损害和临床症状。

最后，虽然在多数研究中蛋白聚集抑制剂能预防神经元损伤，但一些体内和体外的研究发现它们不能阻止（甚至增加）细胞死亡。

这些结果提示导致神经退性变的真正原因可能发生在错误折叠过程中或低聚体形成的早期阶段，而不是脑中成熟的聚集沉淀物。

这一假说得到下述结果的支持，即纯化的亚聚体和原纤维具有与成熟淀粉样纤维相似或更大的毒性。

有学者认为淀粉样纤维的形成可能是一种保护机制，封闭和隔绝了有毒性的中间体。

换言之，可溶性的错误折叠中间体和淀粉样纤维均有毒性，但作用机制不同。

前者可能是通过信号通路(signaling pathway)引起凋亡；而后者可能是占据组织间隙，破坏神经元间联系，再生细胞损伤因子。

此外，最近的发现使关于蛋白质沉淀斑是稳定不变的观点发生了改变，聚集体中的蛋白质组分与各种可溶性蛋白质间可能处于一种动态平衡，这也使了解神经退性变的各种机制更加困难。

（2）炎症假说
这一假说认为异常的蛋白质聚集物作为一种刺激因子，在脑组织中引起慢性炎症反应，导致神经元死亡和突触改变。

其证据有，在大多数神经退性变脑组织中有广泛的星形细胞增生，小胶质细胞的激活和炎症反应蛋白的聚集，如补体蛋白、补体抑制剂、蛋白酶、蛋白酶
抑制剂等。

离体研究表明错误折叠和聚集的蛋白质能刺激小胶质细胞和星形细胞释放炎性物质。

而且，临床治疗也表明用非类固醇抗炎药治疗，可使动物模型和人的AD发病率降低。

但也有研究表明在这些疾病中炎性反应或许是有益的。

在AD的转基因动物模型，用补体C3抑制剂能增加神经退性变和斑块沉积；接种Aβ引起的免疫反应能明显减轻脑淀粉斑和改善行为和认知功能。

上述结果表明，在神经退性变疾病中脑组织的炎症反应是一把双刃剑，同时具有正、反两方面的作用。

（3） 功能丧失假说（the loss of function）
这一观点认为神经元的退行性变化是蛋白质正常功能丧失所致。

最初的证据来于在ALS 发现错误折叠的蛋白质能催化有毒的超氧化物阴离子转变成过氧化氢。

另报道Aβ和PrP 在体外有超氧化物歧化酶的活性，说明蛋白质和一些有活性的氧化还原作用金属离子之间有异常反应，导致一些活性氧基团的生成而引起神经退性变。

五针对蛋白质错误折叠可采取的治疗途径
尽管对神经退性变疾病的病理有了较多了解，但至今还未有成功的治疗方法。

如果蛋白质的错误折叠和聚集是其病理的中心环节，则治疗方案就应针对其设计，有四种可能的考虑[1]。

一是稳定天然蛋白的折叠构象，（图7a）。

在prion感染的神经细胞可用化学伴侣(chemical chaperones)预防PrP的错误折叠。

据报道与天然蛋白结合的小分子物质能稳定A β结构。

设想用蛋白质工程构造一种程序修改蛋白，其稳定性高 错误折叠倾向低，能阻止各种蛋白聚集，但具体实施有赖于复杂的基因治疗技术。

图7 防治蛋白质错误折叠的可能方法
二是用化合物抑制或反转已错误折叠和聚集的蛋白。

在稳定正常蛋白的同时可考虑破坏错误折叠蛋白中病理性β片层结构的稳定性。

例如可用β片层阻断肽阻止蛋白的错误折叠（图7b）。

已经设计了用于阻止Aβ和PrP134-136构象变化和聚集的阻断肽。

另有报道IDOX(4碘-4脱氧doxorubicin)和四环素能抑制蛋白质错误折叠、解聚一些已形成的聚合物。

三是能竞争性阻止蛋白质相互作用的化合物也常用于抑制聚集。

有两类竞争剂，一是阻止单分子间相互作用的化合物，（图7c）,二是在边缘堆积，阻止片层生长的低聚分子，（图7d）。

但由于很难实验性确定竞争性抑制剂的作用机制，又不知道在蛋白质聚集过程中哪个环节产生的毒性物质最强，因此一些抑制剂有可能引起一些中间体的蓄积而加重疾病。

已报道可用于预防蛋白质聚集的物质有：对分子内β片层有亲和力的小分子（如刚果红等）、蛋白质错误折叠过程中的碎片、特异抗体和能与β片层聚集蛋白质相互作用的蛋白质。

四是增加错误折叠和聚集蛋白质的清除，（图7e）。

已发现蛋白质的堆积取决于沉淀和清除的平衡。

这方面最有希望的是曾在AD中试验的免疫方法。

用合成的Aβ聚集体做抗原，使机体免疫产生的抗体清除它们。

在AD的转基因动物模型中观察到，用此法能减少淀粉斑，减轻脑损害和行为失常。

但在人体的实验，由于发生了一些脑膜炎而终止，此副作用原因不清。

用主要刺激B细胞的Aβ片段或用抗错误折叠蛋白的抗体被动免疫可能更安全些。

六结语
神经退性变疾病发病的关键问题是脑组织中异常蛋白的错误折叠和聚集。

每种疾病与不同蛋白的折叠有关，但导致错误折叠的分子途径和神经细胞死亡的机制似乎是相似的。

这为建立治疗方法提供了一种途径。

而且据此建立的治疗措施也将证明蛋白质构象转换在其病理学中的作用。

或许更引人注意的研究方向是其他疾病是否也与蛋白质的折叠变化有关，后者是否是一种更普遍的现象。

多年以来，一直认为错误折叠和淀粉样聚集只是针对特殊的异常蛋白。

但最近的研究表明许多（即使不是全部）蛋白在适当条件下可形成淀粉样结构。

并发现哺乳动物朊蛋白和一些酵母蛋白能够通过蛋白质从一个分子到另一个分子的结构转换传递生物信息，这为生物学的研究打开了一个新的领域。

生物信息通过有选择的蛋白质折叠传递可能代表了一种改变蛋白质活性的天然快速方式。

这种方式能允许有机体在一代内发生适应环境的进化，而不必需要基因的改变，这将使对生物学的认识发生革命性的变化[1]。

总之, 蛋白质的结构转换与蛋白质功能和蛋白质积聚问题已开始受到人们的关注. 对下列几个疑难问题的认识, 将会对生命科学的发展产生重大影响.a.蛋白质折叠是受热力学还是动力学控制;b.结构转换的生物学意义;c.α/β转换有多大的普遍性, 其诱发因素是什么;d.蛋白质在什么条件下会形成积聚(淀粉样化), 它与人类疾病的关系;e.为什么prion蛋白有传染性, 它跟DNA遗传和传染有无关系.f.基因变异所产生的疾病有多少是与蛋白质折叠有关[2]。

参考文献
1. Soto C.Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative
diseases.Nature reviews,volume 4:49 (2003）
2. 胡红雨 许根俊. 蛋白质的结构转换.生物化学与生物物理进展1999年 No.1
3. 周筠梅.蛋白质的错误折叠与疾病.生物化学与生物物理进展2000；27（6） 579
4. 李剑 王志珍细胞内的大分子拥挤环境. 生物化学与生物物理进展2001,28(6):788。