SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS－PAＧE测定蛋白质相对分子质量一、前言

聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称ＰＡGE,就是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质得一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合得常用方法有两种：化学聚合法与光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（ＡP Ｓ)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED）为加速剂。在聚合过程中,ＴEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统与不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷与分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度得不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶就是由AP催化聚合而成得大孔胶，凝胶缓冲液为ｐH６、７得Tｒis-HCｌ。分离胶就是由ＡP催化聚合而成得小孔胶,凝胶缓冲液为pH８、９Triｓ-HCl.电极缓冲液就是pH8、3 Tris—甘氨酸缓冲液.2种孔径得凝胶、２种缓冲体系、3种ｐH值使不连续体系形成了凝胶孔径、ｐＨ值、缓冲液离子成分得不连续性，这就是样品

浓缩得主要因素.

ＳDS就是阴离子去污剂,作为变性剂与助溶试剂,它能断裂分子内与分子间得氢键,使分子去折叠，破坏蛋白分子得二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间得二硫键断裂。在样品与凝胶中加入还原剂与SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后得氨基酸侧链与ＳDＳ结合成蛋白－ＳDS胶束，所带得负电荷大大超过了蛋白原有得电荷量,这样就消除了不同分子间得电荷差异与结构差异。

SDS—PＡGE一般采用得就是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高得分辨率.

浓缩胶得作用就是有堆积作用，凝胶浓度较小,孔径较大，把较稀得样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶得迁移作用而被浓缩至一个狭窄得区带。当样品液与浓缩胶选TRIＳ/HCl缓冲液,电极液选TＲＩS/甘氨酸。电泳开始后,HＣl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量得甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高得电场强度，使蛋白与甘氨酸根离子迅速移动,形成一稳定得界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层.

此鉴定方法中，蛋白质得迁移率主要取决于它得相对分子质量，而与所带电荷与分子形状无关.

聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理

聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应．它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Natiｖe—PAGE)及SDS—聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ—ＰAＧE);非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳得过程中,蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质得分子量大小、蛋白质得形状及其所附带得电荷量而逐渐呈梯度分开。

而ＳDS—ＰAＧE仅根据蛋白质亚基分子量得不同就可以分开蛋白质。该技术最初由sｈapiｒｏ于196７年建立，她们发现在样品介质与丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂与强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后,蛋白质亚基得电泳迁移率主要取决于亚基分子量得大小（可以忽略电荷因素)。

二、实验目得

1、学习ＳDＳ-PＡGE测定蛋白质分子量得原理.

2、掌握垂直板电泳得操作方法。

3、运用ＳDＳ—PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。

三、实验原理

１、电泳

带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反得电极移动得现象。在一定得电场强度下,分子在凝胶介质中得迁移速率取决于分子得大小、构型与带电量得大小.

2、PAＧE

聚丙烯酰胺凝胶(ＰAG)就是由单体丙烯酰胺(Acr)与交联剂甲叉双丙烯酰胺(Biｓ)在加速剂四甲基乙二胺(TEＭED）与引发剂过硫酸

铵(AＰ) 得作用下聚合交联而成得三维网状结构得凝胶。以此凝胶作为支持介质得电泳称为PＡＧE.PAGＥ具有电泳与分子筛得双重作用。

PAＧ机械强度好,有弹性,透明，化学性质稳定,改变Acr浓度或Acr与Bis得比例可以得到不同孔径得凝胶。

PＡGＥ分为连续系统与不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中得相同、带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷与分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

3、SＤS—PAＧE基本原理

ＳDＳ—ＰAGE就是在蛋白质样品中加入SＤS与含有巯基乙醇得样品处理液，SDS就是一种很强得阴离子表面活性剂，它可以断开分子内与分子间得氢键,破坏蛋白质分子得二级与三级结构。

强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质得四级结构.使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子．解聚后得侧链与ＳDS充分结合形成带负电荷得蛋白质—ＳDS复合物。

蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷得量远远超过了它原有得净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷得差异。蛋白质得电泳迁移率主要决定于亚基得相对分子质量。而与其所带电荷得性质无关。

当蛋白质得分子量在1７，000~16５,00０之间时, 蛋白质－S

ＤS复合物得电泳迁移率与蛋白质分子量得对数呈线性关系:

lgMW = K —bm

将已知分子量得标准蛋白质在SＤS—PAＧE 中得电泳迁移率对分子量得对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量得蛋白质在相同条件下得电泳迁移率,就能根据标准曲线求得其分子量.

四、实验器材与材料试剂

仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;5０或10０μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯;吸量管;常头滴管等。

原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白０、5-1mgml—1样品溶解液配制．可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液．

试剂：(１)分离胶缓冲液(Ｔris—ＨCｌ缓冲液PH8、9):取1ｍol／L盐酸４8mL,Tｒis ３６、3ｇ,用无离子水溶解后定容至100mＬ；

（2)浓缩胶缓冲液(Trｉs-HCl缓冲液ＰＨ6、7):取1mol/Ｌ盐酸４8mL，Tｒis ５、98ｇ,用无离子水溶解后定容至１０0ｍＬ;

(3)3０%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺(Acr) 3０g及Ｎ，Ｎ’-甲叉双丙烯酰胺(Ｂis)0、8g,溶于重蒸水中,最后定容至100mｌ,过滤后置棕色试剂瓶中,4保存；

(4)10％浓缩胶贮液:称Aｃr 10ｇ及Bis ０、5g,溶于重蒸水中,最后定容至1０0mL，过滤后置棕色试剂瓶中,4贮存;