第二章-3 目的基因获得-9.15
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可用T载体克隆。
5’
A
A
5’
PCR扩增产物
T7 lacZ MCS ori Ampr
5’
T
T
5’
T载体
（三）从mRNA合成cDNA
以目的基因的mRNA为模板，在逆 转录酶作用下合成cDNA第一链，然后在 Klenow酶作用下合成双链cDNA。
此 法 适 用 于 mRNA 丰 度 极 高 的 目 的 基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。
目的基因内部不能有该限制酶的切点， 否则目的基因会被切成碎片！
Ampr
f1ori lacZ
pGEM-T/hVEGF165 hVEGF165 3.5 Kb
SnaB I EcoR I Avr II Not I
EcoR I Not I
5’AOX1 hVEGF165
Bgl II Ampr
pPIC9K/hVEGF165 9.8 Kb
PCR技术的发明--DNA操作技术的革命 发明人：美国生化学家Kary B. Mullis
1990.04 Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 1990,262(4):56-61,64-5.
1986.05 冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会
1987.01 Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology. 1987,155:335-50.
Klenow酶合成cDNA第二链
1989
Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首， 比喻1989年为PCR爆炸年。
1991.12 Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-La Roche公司
Eppendorf
Bio-rad
ABI
PCR法扩增目的基因的前提： 已知目的基因全序列或其两侧序列，
化学合成与模板互补的上、下游引物。
1998.04 Mullis KB. Dancing naked in the mind fields.
The Nobel Prize in Chemistry 1993
1972 1979
在加州大学伯克利分校获得博士学位 进入私人生物技术公司Cetus
1983.03 开汽车时的联想： 蜿蜒崎岖的山路--DNA双螺旋 行驶的汽车--一小段DNA引物
变性：双链DNA解链为单 链DNA；
变性
退火：引 物 与 模 板 单 链
退火
DNA的特定互补部 位配对、结合；
延伸
延伸：以目的基因为模板， 合成互补的新DNA 链。
由于每一循环所产生的DNA片段均能成为 下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增 加，即Y=2n (n为循环次数)。
30th cycle？ 230(109)copies
1986.06 Saiki等将耐热DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技术。
1986.09 Mullis离开Cetus公司
1988.01 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988,239(4839):487-91.
问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。
原因：Taq酶无3’→5’外切酶活性，无阅 读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30 次循环Taq酶错配率约0.25％。
措施：选择高保真Taq酶，如Pfu。
由Taq酶扩增的PCR产物，3’末端总是带有 一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎 总是A，因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。
哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白 mRNA的比例占总mRNA的90%以上。
高丰度mRNA： 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质
总mRNA量的50-90%。
低丰度mRNA： 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质
总mRNA量的0.5%以下。
百度文库
步骤：
钓取目的基因的mRNA
逆转录酶催化合成cDNA第一链
逆转录酶去除mRNA-cDNA 杂交链中的mRNA链
HIS4
5’ AOX1
Bgl II
Ampr
pPIC9K
9.3 Kb
ColE1 Bgl II
3’ AOX1
Kanr
HIS4
ColE1
Bgl II 3’AOX1 Kanr
（二）PCR法扩增目的基因
PCR(polymerase chain reaction)： 利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通
过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅 速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。
1983.08 正式做有关PCR原理的报告 1983.09 Mullis开始动手做实验 1984.11 首次取得可信结果 1985.01 Randall Saiki加入，结果毋庸置疑
1985.03 Cetus公司申请专利
1985.12 Saiki RK, Scharf SJ, Faloona FA, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985,230(4732):1350-4.
第二章 基因工程的基本条件
一、用于核酸操作的工具酶 二、基因克隆载体 三、目的基因的获得 四、基因工程受体菌或细胞
三、目的基因的获得
限制酶酶切直接分离法 PCR扩增法 从mRNA合成cDNA 化学合成法 通过构建基因文库分离法
（一）限制酶酶切直接分离法
对已克隆在载体中的目的基因，可根 据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择 适当的限制酶酶切，获得目的基因。 注意：
5’
A
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PCR扩增产物
T7 lacZ MCS ori Ampr
5’
T
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T载体
（三）从mRNA合成cDNA
以目的基因的mRNA为模板，在逆 转录酶作用下合成cDNA第一链，然后在 Klenow酶作用下合成双链cDNA。
此 法 适 用 于 mRNA 丰 度 极 高 的 目 的 基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。
目的基因内部不能有该限制酶的切点， 否则目的基因会被切成碎片！
Ampr
f1ori lacZ
pGEM-T/hVEGF165 hVEGF165 3.5 Kb
SnaB I EcoR I Avr II Not I
EcoR I Not I
5’AOX1 hVEGF165
Bgl II Ampr
pPIC9K/hVEGF165 9.8 Kb
PCR技术的发明--DNA操作技术的革命 发明人：美国生化学家Kary B. Mullis
1990.04 Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 1990,262(4):56-61,64-5.
1986.05 冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会
1987.01 Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology. 1987,155:335-50.
Klenow酶合成cDNA第二链
1989
Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首， 比喻1989年为PCR爆炸年。
1991.12 Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-La Roche公司
Eppendorf
Bio-rad
ABI
PCR法扩增目的基因的前提： 已知目的基因全序列或其两侧序列，
化学合成与模板互补的上、下游引物。
1998.04 Mullis KB. Dancing naked in the mind fields.
The Nobel Prize in Chemistry 1993
1972 1979
在加州大学伯克利分校获得博士学位 进入私人生物技术公司Cetus
1983.03 开汽车时的联想： 蜿蜒崎岖的山路--DNA双螺旋 行驶的汽车--一小段DNA引物
变性：双链DNA解链为单 链DNA；
变性
退火：引 物 与 模 板 单 链
退火
DNA的特定互补部 位配对、结合；
延伸
延伸：以目的基因为模板， 合成互补的新DNA 链。
由于每一循环所产生的DNA片段均能成为 下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增 加，即Y=2n (n为循环次数)。
30th cycle？ 230(109)copies
1986.06 Saiki等将耐热DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技术。
1986.09 Mullis离开Cetus公司
1988.01 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988,239(4839):487-91.
问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。
原因：Taq酶无3’→5’外切酶活性，无阅 读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30 次循环Taq酶错配率约0.25％。
措施：选择高保真Taq酶，如Pfu。
由Taq酶扩增的PCR产物，3’末端总是带有 一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎 总是A，因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。
哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白 mRNA的比例占总mRNA的90%以上。
高丰度mRNA： 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质
总mRNA量的50-90%。
低丰度mRNA： 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质
总mRNA量的0.5%以下。
百度文库
步骤：
钓取目的基因的mRNA
逆转录酶催化合成cDNA第一链
逆转录酶去除mRNA-cDNA 杂交链中的mRNA链
HIS4
5’ AOX1
Bgl II
Ampr
pPIC9K
9.3 Kb
ColE1 Bgl II
3’ AOX1
Kanr
HIS4
ColE1
Bgl II 3’AOX1 Kanr
（二）PCR法扩增目的基因
PCR(polymerase chain reaction)： 利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通
过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅 速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。
1983.08 正式做有关PCR原理的报告 1983.09 Mullis开始动手做实验 1984.11 首次取得可信结果 1985.01 Randall Saiki加入，结果毋庸置疑
1985.03 Cetus公司申请专利
1985.12 Saiki RK, Scharf SJ, Faloona FA, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985,230(4732):1350-4.
第二章 基因工程的基本条件
一、用于核酸操作的工具酶 二、基因克隆载体 三、目的基因的获得 四、基因工程受体菌或细胞
三、目的基因的获得
限制酶酶切直接分离法 PCR扩增法 从mRNA合成cDNA 化学合成法 通过构建基因文库分离法
（一）限制酶酶切直接分离法
对已克隆在载体中的目的基因，可根 据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择 适当的限制酶酶切，获得目的基因。 注意：