实验一 酵母菌株的筛选分离

一、实验目的：

1.通过酒母中酵母的筛选实验，熟悉微生物分离纯化、接种微生物操作实验；

2.熟悉产酒精酵母的TTC显色平板等性能筛选实验；

二、实验材料与仪器：

培养基：YPD培养基、MEB、TTC显色培养基；

酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、TTC、0.1%吕氏碱性美蓝

仪器：灭菌锅、恒温培养箱、厌氧培养箱；

移液管、涂布棒，接种环，平板、三角瓶、试管（15*150mm）、硅胶塞、杜氏小倒管、纱布、报纸；

三、实验步骤：

1.1 培养基的配制

YPDS固体培养基（1L）：称取酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g溶于1L的水当中，分装到三角瓶中后加入2%琼脂粉，115℃灭菌20min；

注：为抑制霉菌菌丝的生长。可在培养基中加入0.5%-1%的脱氧胆酸钠。

YPD液体培养基（1L）：按YPDS配方配制，不加琼脂，121℃灭菌20min；TTC显色培养基：每100mlYPDS培养基中加入0.05g的TTC；

1.2 酵母的分离纯化：

1.2.1 梯度稀释将酒样混匀后取1ml加入到9ml的无菌水中制成10-1浓度梯度，之后从中取出1ml再加入到9ml的无菌水当中，浓度梯度为10-2，依次往下推，分别制得10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度的菌液；

1.2.2 涂布将稀释得到的10-2,10-3,10-4三个梯度的菌液取0.5 ml到预先倒好的TTC显色培养基平板中，沿一个方向均匀的进行涂布，然后将涂布好的平板用报纸包好避光培养，倒置于恒温厌氧培养箱中28℃培养2-3d。

1.3 酵母的保藏

将划线纯化后的酵母菌株接种在YPDS斜面试管上，用记号笔写上将接种的菌名、日期和接种者，28℃培养1-2d，培养好后放置于4℃冰箱保存；

四、实验结果

1、对实验过程中所得到的实验结果进行拍照；

注：左上图浓度梯度10-2，右上图浓度梯度10-3

左下图浓度梯度10-4，右下图为酵母菌株接种在YPDS 斜面试管

2、 记录所筛选到酵母菌株的颜色分级并进行编号；

酵母菌株的颜色随浓度梯度增加而变深，如颜色深：10-2>10-3>10-4

五、思考题

1、涂布之前稀释的目的？

答：稀释涂布平板的目的是降低菌的浓度.浓度过高的菌会在培养基上长出过多的菌落,以至于没法挑出单菌落,那样就无法获得单一种类的菌,或者无法统计菌落数来计算菌液浓度了.

2、如何获得纯化的微生物菌株？ 答：

1）划线分离法

2）稀释分离法

3）组织分离法

3、酵母菌TTC 筛选的原理是什么？

答：TTC （2，3，5一氯化苯基四氮哇）是一种显示剂。它对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低。在一定培养基上配以的酵母菌落上覆盖一层TTC 显示剂会显示不同颜色，产酒精能力强的酵母菌落成深红色，次之为粉红色。